染色体の再構成とナノ構造解析による染色体折りたたみ分子機構の解明

通过染色体重排和纳米结构分析阐明染色体折叠的分子机制

基本信息

批准号：
15770066
负责人：
吉村成弘
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15770066/
关键词：
染色体クロマチン核内マトリクス原子間力顕微鏡

项目摘要

発現ライブラリのスクリーニングによるモノクローナル抗体の抗原決定・染色体より抽出したタンパク質を抗原としてハイブリドーマを作成し、54種190個のクローンを得た。・54種のうち、22個は核内の構造物を、11個は細胞骨格、7個は紡錘体、14個はその他の細胞内器官を認識した。・発現ライブラリのスクリーニングにより、10種類のハイブリドーマに関して抗原を決定した。・モノクローナル抗体(#04A)の抗原として同定された新規タンパク質は、641アミノ酸から構成され、中央部にJmjCドメイン、N末端近傍に核局在シグナル(NLS)を持つものであった。・このタンパク質にタグを付加してHeLa細胞で発現させると、核小体への局在が確認された。試験管内での高次クロマチンファイバーの再構成3kbから100kbまで長さの異なるプラスミドDNA(環状スーパーコイル状態)を調整し、これらを用いて塩透析法でクロマチンファイバーを再構成した。これを原子間力顕微鏡を用いて観察・解析し、次のような成果を得た・用いたDNAが長いほど、高い密度でヌクレオソームが形成される。・この相関関係は、負にスーパーコイルした環状プラスミドにのみみられ、直鎖状DNAや、弛緩型環状プラスミドではみられなかった。・リンカーヒストンH1を加えると、クロマチンがさらに折りたたまれて、より太いファイバー状の構造を形成される。ハイブリッドイメージング技法の確立AFM像中に、特定のタンパク質の所在をプロットするために、AFMと蛍光顕微鏡とを組み合わせたシステムを構築した。GFPを融合させたPMLタンパク質(核内マトリクスに局在)をガラス基板上で培養したHeLa細胞内に発現させ、その基板上で核マトリクスを精製したのちこれを蛍光顕微鏡とAFMとで観察した結果、PMLタンパク質が局在する部位(PMLボディー)の微細構造をAFMで観察することに成功した。

通过筛选表达文库来测定单克隆抗体的抗原测定；使用从染色体提取的抗原提取的蛋白质创建杂交瘤，并获得了54种的190个克隆。在54种，有22种核内公认的结构中，有11个识别的细胞骨架，7个公认的纺锤体和14个识别其他细胞内器官。 - 通过筛选表达文库来确定10个杂交瘤的抗原。 - 新型蛋白质被鉴定为单克隆抗体（＃04A）的抗原，由641个氨基酸组成，在中部地区具有JMJC结构域，在N末端附近具有核定位信号（NLS）。 - 当该蛋白在HeLa细胞中标记并表达时，确认了对核仁的定位。测试管中高阶染色质纤维的重建。调节具有不同长度的质粒DNA（圆形超螺旋状态），并通过盐透析使用这些长度不同，并使用这些长度进行调整。使用原子力显微镜观察并分析了这一点，并获得了以下结果，并且使用的DNA越长，形成核小体的密度越高。这种相关性仅在否定超螺旋的圆质粒中，而不是线性DNA或松弛的圆质粒。 •添加接头组蛋白H1进一步折叠染色质，形成较厚的纤维状结构。建立混合成像技术，构建了将AFM和荧光显微镜组合的系统，以绘制特定蛋白在AFM图像中的位置。用GFP融合的PML蛋白（位于核基质中）在玻璃基板上培养的HeLa细胞中表达，在纯化基质上的核基质纯化后，然后使用荧光显微镜和AFM观察核基质，结果是使用PML Protein的微观结构来观察PML Protim insiped（PMM）。