海洋性超好熱古細菌ゲノムの網羅的機能解析に向けた遺伝子操作系の開発

开发用于海洋超嗜热古菌基因组综合功能分析的遗传操作系统

基本信息

批准号：
03J04791
负责人：
田中礼士
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度も、前年に引き続き、より汎用性の高いベクター系の構築を目指し、新規のAeropyrum株の分離をおこなった。本年度は九州、小浜温泉においてサンプリングを行い、本菌の分離を試みた結果、新規のAeropyrum株を分離することに成功した。タイプストレインとのDNA-DNA交雑試験を行った結果、73%の値を得たことから、小浜株はA.pernixと同種であるものの、遺伝的に多様な変異を獲得している可能性が示唆された。また宿主ライブラリーの拡充には遺伝的多様の高い株を得ることが必須であることから、分離した株の多様性を瞬時に測ることができる分子マーカーの選択を行った。本年度はAFLPを用いて本菌の種内多様を解析することを目的とした。実験に供試した35株のAeropyrum pernixからゲノムDNAを抽出した後、市販キットを用いてAFLP解析を行った。なお、セレクティブプライマーは+A、+T、+Gを用いて信頼性の向上を図った。また、バンドの抽出にはGeneScan 3.1 software(Applied Biosystems, USA)を用いた。クラスター解析にはDice coefficient and the Ward algorithmを用いてBioNumerics 3.0 software(Applied Maths, Belgium)にて行った。AFLP解析の結果、A.pernixは分離した地域ごとにクラスターを形成した。さらに同一の地域でも物理的な特性の違う泉源ごとに、さらなる変異が確認できた。この結果より、A.pernixは環境からの制約を大きく受け泉源ごとに種内変異を持つことが確認された。今後、これらの変異を有する株についてそれぞれ、遺伝子改変系を応用し、改変可能株であるかどうかのスクリーニングを行うことが望まれる。

今年，与上一年一样，我们还隔离了新的Aeropyrum菌株，目的是建立更通用的向量系统。今年，在九州的奥巴马·奥恩森（Obama Onsen）进行了样品，并试图隔离细菌，并且由于新的Aeropyrum菌株的分离，我们成功地隔离了它们。与类型菌株的DNA-DNA交叉测试产生了73％的值，这表明尽管奥巴马菌株与A. pernix的物种相同，但它可能已经获得了遗传上不同的突变。此外，由于要获得高度遗传多样的菌株以扩大宿主文库至关重要，因此我们选择了一个可以立即测量孤立菌株多样性的分子标记。今年，目的是使用AFLP分析该细菌的种内多样性。从实验中测试的35个Aeropyrum Pernix菌株中提取基因组DNA，并使用市售试剂盒进行AFLP分析。此外，选择性引物为 +a， +t和 +g，以提高可靠性。此外，Genescan 3.1软件（美国应用生物系统）用于提取频段。使用Bionumerics 3.0软件（Applied Maths，Belgium）使用Dice Core和Ward算法进行聚类分析。由于AFLP分析，A.Pernix在每个分离的区域中形成簇。此外，在每个春季源中证实了进一步的突变，在同一区域中具有不同的物理特征。这些结果证实，在每个春季来源，pernix在很大程度上受到了环境限制和种内突变的约束。希望将来，每个带有这些突变的菌株都将应用于遗传修饰的系统，以筛选它是否是可修改的菌株。