Csk・Cbp及びそれら複合体の結晶解析によるCsk活性制御機構の解明

通过 Csk、Cbp 及其复合物的晶体分析阐明 Csk 活性的控制机制

基本信息

批准号：
03J04152
负责人：
小川輝
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J04152/
关键词：
Csk Cbp X線構造解析超分子複合体結晶構造解析チロシンキナーゼ lime

项目摘要

本研究ではチロシンキナーゼCskとアダプター蛋白質Cbpの複合体を結晶構造解析することを目的とした。私は複数のCbp欠損変異体組換え蛋白質発現系を構築し、発現精製を行った。精製したCbp蛋白質はバキュロウイルス発現系を用いて調製したFynによってリン酸化した。リン酸化したCbp欠損変異体蛋白質と組操えCskを混合することによりCsk-Cbp複合体の試験管内再構成に成功した。再構成した複合体蛋白質試料を用いて結晶化条件の探索を行ったが、現在までに複合体の結晶は得られていない。プロテアーゼによる限定分解実験の結果などから、私はCbp-Csk複合体の結晶が得られない要因の一つとしてCbpの構造がフレキシブルであることを疑った。この問題を克服するために、私はCbpにおけるCskとの相互作用に必要かつ十分な領域を決定しその部分だけを用いて複合体の再構成を行うことを試みた。このためにまず、様々なCbpの欠損変異体を試験管内リン酸化してCskと試験管内で結合するかを調べた。CbpとCskが結合していることの判定にはゲルろ過クロマトグラフィーによるアッセイ系を用いた。この実験の結果、CbpはCskのSH2ドメインとリン酸化チロシン以下4残基という既知の様式に加え、そのN末端側に位置するチロシンを含む領域を用いても相互作用を行っていることが分かった。この結果は1Mの硫酸アンモニウムという高イオン強度条件でも維持されるほどのCsk-Cbp結合の強さの要因が、従来知られている様式によるSH2-リン酸チロシン間相互作用よりも広範な相互作用を行っていることにあることを示唆している。上記の実験の結果から複合体の構造解析に用いるべきCbpの領域が完全に決定できたと考える。

这项研究旨在分析酪氨酸激酶CSK和衔接蛋白CBP复合物的晶体结构。我构建了多个CBP缺陷的突变体重组蛋白表达系统，并纯化了它们。纯化的CBP蛋白通过FYN磷酸化，并使用杆状病毒表达系统制备。通过将磷酸化的CBP缺陷型突变蛋白与联合CSK混合，成功地进行了CSK-CBP复合物的体外重建。尽管使用重构的复杂蛋白样品搜索了结晶条件，但迄今为止尚未获得该复合物的晶体。基于使用蛋白酶有限分解实验的结果，我怀疑CBP的结构是阻止CBP-CSK复合物晶体的因素之一。为了克服这个问题，我试图确定与CBP中CSK相互作用的所需和足够的区域，并仅使用该部分重建复合物。为此，我们首先检查了是否在体外磷酸化了各种CBP缺乏的突变体是否在体外结合CSK。为了确定CBP和CSK是否是绑定的，使用了凝胶过滤色谱法的测定系统。该实验表明，CBP与CSK的SH2结构域和磷酸酪氨酸的四个残基相互作用，并使用了位于N末端的酪氨酸的区域。该结果表明，即使在1M硫酸铵的高离子强度条件下，CSK-CBP键的强度也足够维持，这是由于比常规众所周知的Manners中SH2-磷酸盐相互作用更广泛的相互作用所致。从上述实验的结果来看，可以完全确定用于复合物结构分析的CBP区域。