精子形成時の強発現するミトコンドリア融合・分裂因子の作用機構と生理的役割の解明

阐明精子发生过程中强烈表达的线粒体融合和裂变因子的作用机制和生理作用

• 批准号: 03J03487
• 负责人: 本田 信治
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J03487/
• 关键词: ミトコンドリア; Mitofusi-2(Mfn2); 膜電位; 変異解析; 精子形成; Mitofusin; Dynamin-related protein

ミトコンドリア融合因子(Mitofusin-2,Mfn2)は,酵母から哺乳類まで大変保存された分子であるが、その分子メカニズムは未開な部分が多く残っている。そこで種々の欠損変位させた遺伝子を作成し,哺乳類細胞に過剰発現させ,ミトコンドリアの形態の変化を詳細に追った。その結果,2つの膜貫通部位を欠損させたMfn2(Mfn2^<ΔTM>)がドミナントネガティブの活性を持つことを発見し,更に種間で保存された膜貫通部位よりN末端とC末端の2つずつの計4つの部位がこの活性に必要であることがわかった。また、Mfn2の膜貫通部位よりN末端部位とC末端部位をそれぞれ培養細胞に過剰発現させた場合、このドミナントネガティブの活性を持たないのに対し,両部位を共発現させた場合にこの活性をもつことがわかった。更に免疫沈降法を行った結果,両部位が相互作用することを確かめた。そして,この相互作用には保存されたN末端の2つの部位が重要で、かつGTPase依存的になされることがわかった。また,Mfn2のN末端とC末端部位の一部を融合させた遺伝子を培養細胞に過剰発現させたところ,ミトコンドリアの膜電位が消失し,この活性には上記のドミナントネガティブの活性に必要な部位の4つのうち2つの部位が重要であることがわかった(JCS, Honda et al.改訂中)。そして,これらの欠損変異解析をもとに酵母のTwo-hybrid assayによりMfn2と相互作用する分子の探索を行い,2つの候補遺伝子を同定した。しかし哺乳類細胞を用いて更なる解析を行ったところ,これらの相互作用は非特異的で,またミトコンドリアの形態変化に影響を示さなかった。また,このMfn2^<ΔTM>を哺乳類細胞に過剰発現させ、この分子を免疫沈降させ相互作用する分子の精製を試みたが,現在のところコントロールと比較して特異的なタンパク質の検出はできなかった。

线粒体融合因子（Mitofusin-2，MFN2）是高度保守的分子，从酵母到哺乳动物，但它们的分子机制仍然存在于许多未发现的部分。然后创建各种缺陷的基因，在哺乳动物细胞中过表达，并详细遵循线粒体形态的变化。结果表明，具有两个跨膜位点缺失的MFN2（MFN2^<ΔTM>）具有显着的负活性，并且该活性是从物种之间保守的跨膜位点的四个位点，两个N末端和C末端。此外，发现在MFN2的跨膜位点的培养细胞中N末端和C末端位点过表达时，它们没有这种显性的负活性，而当两个位点共表达时，它们都会表现出这种活性。此外，进行免疫沉淀以确认两个地点相互作用。然后发现两个保守的N末端位点对于这种相互作用很重要，并且依赖GTPase。此外，当在培养细胞中融合了MFN2的N末端和C末端位点的基因时，线粒体膜电位消失了，并且发现上述主导性负活性所需的四个位点中的两个位点对这种活性很重要（JCS，Honda et persion corpision corpision corpision nife vission nife vission nife corpision。基于这些缺失突变分析，使用酵母中的两个杂交测定法来搜索与MFN2相互作用的分子，并鉴定了两个候选基因。然而，使用哺乳动物细胞进行了进一步的分析，这些相互作用是非特异性的，并且对线粒体形态变化没有影响。此外，尽管MFN2^<ΔTM>在哺乳动物细胞中过表达，但免疫沉淀该分子并试图净化与其相互作用的分子，但目前不可能检测到与对照组相比的特定蛋白质。

项目成果

FHL5, a novel actin-binding protein, is highly expressed in eel gill pillar cells and responds to wall tension

• DOI: 10.1152/ajpregu.00108.2004
• 发表时间: 2004-11-01
• 期刊: AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-REGULATORY INTEGRATIVE AND COMPARATIVE PHYSIOLOGY
• 影响因子: 2.8
• 作者: Mistry, AC;Kato, A;Hirose, S
• 通讯作者: Hirose, S

Honda, S., Hirose, S.: "Stage-specific enhanced expression of mitochondorial fusion and fission factors during spermatogenesis in rat testis"Biochemical and Biophysical Research Communications. 311. 424-432 (2003)

Honda, S., Hirose, S.：“大鼠睾丸精子发生过程中线粒体融合和裂变因子的阶段特异性增强表达”生物化学和生物物理研究通讯。