酵母のメタノール誘導性遺伝子発現の分子基盤とその応用利用開発

甲醇诱导酵母基因表达的分子基础及其应用开发

• 批准号: 14760048
• 负责人: 由里本 博也
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14760048/
• 关键词: メタノール; Candida boidinii; Pichia pastoris; アルコールオキシダーゼ; ジヒドロキシアセトンシンターゼ; プロモーター; 遺伝子発現調節; 転写因子; ホルムアルデヒド

メタノール資化性酵母Candida boidiniiのメタノール誘導性遺伝子のうち、前年度のアルコールオキシダーゼ遺伝子(AOD1)、ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子(DAS1)に続き、ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(FDH1)プロモーターのメタノール応答領域(cis-element)を決定した。これら3つのプロモーターのメタノール応答領域に特異的に結合する転写因子(trans-activator)をゲルシフトアッセイにより探索したところ、DAS1プロモーターについてのみその存在が確認できた。AOD1,FDH1プロモーターの応答領域については、応答領域に特異的に結合するタンパク質の存在が確認されなかった。DAS1プロモーターのメタノール応答領域に結合するタンパク質については、ゲルシフトアッセイを指標にして当該タンパク質の単離を試みている。同じくメタノール資化性酵母であるPiohia pastorisにgene-tagging法を適用し、メタノール生育能を失った変異株を多数取得した。得られた変異株の変異原因遺伝子を特定し、各種データベースと比較することにより、DNA結合能を有すると考えられるZinc finger motifを保つタンパク質を見出した。この相同遺伝子をC.boidiniiよりクローニングしたところ、その推定アミノ酸配列はP.pastorisの当該遺伝子およびSaccharomyces cerevisiaeの推定転写活性化因子と高い相同性を示した。C.boidiniiにおいてこの遺伝子を破壊した株ではAOD1プロモーター活性が顕著に低下していた。今後本遺伝子産物を精製し、AOD1プロモーターのどの領域に結合するかを明らかにして行く。

在甲醇同化酵母博伊丁假丝酵母的甲醇诱导基因中，甲酸脱氢酶基因（FDH1）启动子的甲醇响应区（顺式元件）紧随乙醇氧化酶基因（AOD1）和二羟基丙酮合酶基因（DAS1） ）从上一年）决定。当我们通过凝胶转移实验寻找与这三个启动子的甲醇响应区特异性结合的转录因子（反式激活因子）时，我们证实它们仅存在于 DAS1 启动子中。关于AOD1和FDH1启动子的响应区域，尚未确认是否存在与响应区域特异性结合的蛋白质。我们正在尝试使用凝胶位移测定作为指示剂来分离与 DAS1 启动子的甲醇响应区域结合的蛋白质。我们将基因标记方法应用于同样是甲醇同化酵母的毕赤酵母，获得了许多失去生长甲醇能力的突变菌株。通过鉴定产生的突变株中负责突变的基因并将其与各种数据库进行比较，我们发现了一种维持锌指基序的蛋白质，该基序被认为具有 DNA 结合能力。当从C. boidinii中克隆该同源基因时，其推导的氨基酸序列与巴斯德毕赤酵母和假定的酿酒酵母转录激活子的基因具有高度同源性。在该基因被破坏的 C. boidinii 菌株中，AOD1 启动子活性显着降低。未来，我们将纯化该基因产物并阐明其与AOD1启动子的哪个区域结合。

项目成果

Yurimoto, H., Lee, B., Yano, T., Sakai, Y., Kato, N.: "Physiological role of S-formylglutathione hydrolase in C_1-metabolism of the methylotrophic yeast Candida boidinii"Microbiology. 149(8). 1971-1979 (2003)

Yurimoto, H.、Lee, B.、Yano, T.、Sakai, Y.、Kato, N.：“S-甲酰谷胱甘肽水解酶在甲基营养酵母博伊丁假丝酵母 C_1 代谢中的生理作用”微生物学。

由里本博也, 阪井康能, 加藤暢夫: "メチロトローフのホルムアルデヒド対策"化学と生物. 41(4). 218-221 (2003)

Hiroya Yurimoto、Yasuyoshi Sakai、Nobuo Kato：“甲基营养菌的甲醛对策”，化学与生物学，218-221（2003）。

阪井康能, 由里本博也: "メタノール資化性酵母Pichia pastorisのゲノム解析「ゲノミクス・プロテオミクスの新展開」"エヌ・ティー・エス(印刷中). (2004)

Yasuyoshi Sakai、Hiroya Yurimoto：“甲醇同化酵母毕赤酵母的基因组分析“基因组学和蛋白质组学的新进展””NTS（印刷中）。

Komeda, T., Yurimoto, H., Kato, N., Sakai, Y., Kondo, K.: "Cis-acting elements sufficient for induction of FDH1 expression by formate in the methylotrophic yeast Candida boidinii"Mol.Gen.Genet.. 270(3). 273-280 (2003)

Komeda, T.、Yurimoto, H.、Kato, N.、Sakai, Y.、Kondo, K.：“顺式作用元件足以在甲基营养酵母博伊丁假丝酵母中诱导 FDH1 表达”Mol.Gen.Genet

Lee, B., et al.: "Physiological role of the glutathione-dependent formal dehyde dehydrogenase in the methyl otrophicyeast Candida boidinii"Microbiology. 148(9). 2697-2704 (2002)

Lee，B.，等人：“谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶在甲基营养酵母博伊丁假丝酵母中的生理作用”微生物学。