機能付与による、細胞療法・再生医工学のための有用動物細胞株の創製

通过添加功能创建用于细胞治疗和再生医学工程的有用动物细胞系

• 批准号: 14750635
• 负责人: 寺田 聡
• 金额: $ 2.56万
• 依托单位: University of Fukui
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14750635/
• 关键词: アポトーシス; ハイブリッド型人工肝臓; HepG2; bcl-2; P35; crmA; bag-1; グルタミン合成酵素; 人工肝臓; p35; チトクロムP450; 温熱; 人工膵臓

ハイブリッド型人工肝臓の機能向上を目指して、人工肝臓に利用される肝細胞株の新規樹立を目指した。前年度までに、bcl-2,p35,crmAといったアポトーシス抑制遺伝子を過剰発現する肝細胞株を樹立した。これら樹立株は、アポトーシスに耐性を示した。本成果をふまえ、今年度は次の二つの戦略で、HepG2細胞をもとに新規肝細胞株の樹立を行った。1.アポトーシスは複数の経路があり、一つを抑制するだけでは十分でない。そこでアポトーシス抑制遺伝子の複数個の同時発現を目指し、「bcl-2とp35」の共発現株と、「bcl-2とbag-1」の共発現株を作成した。これらは、期待通り、単独発現株より強いアポトーシス耐性を示した。一方で、これらの株は増殖がやや低下した。期待通り、これらはいずれも、人工肝臓内で問題となる低酸素環境中でも、細胞死にも耐性を示し、肝機能の持続が認められた。2.アポトーシス耐性付与だけでは人工肝臓の機能向上には不十分である。そこで、アポトーシス耐性遺伝子bcl-2に加えて、同時に肝機能に関わる遺伝子の過剰発現株の作成を目指した。具体的には、肝機能の中ではアンモニア除去が重要であることから、グルタミン合成酵素(GS)遺伝子の導入を行った。GSは、グルタミン酸とアンモニアからグルタミンを合成する酵素である。GS遺伝子導入後、約半年にわたって遺伝子増幅を行った結果、アンモニア除去能が5倍近く、飛躍的に向上した株が樹立された。この細胞では、アポトーシス抑制遺伝子bcl-2の発現が若干低下した。なお、GSの利用は大阪大学の大政が最初に行ったもので、本研究でも大政の協力で遂行された。以上を通じて樹立された新規細胞株は、ハイブリッド型人工肝臓の機能向上に寄与できるものと期待している。

为了改善杂化型人工肝的功能，我们旨在建立一种新的肝细胞树。到上一年，建立了过多凋亡（例如Bcl-2，p35和CRMA）的肝细胞。这些状态表明凋亡。根据结果​​，今年，基于HEPG2细胞的以下两种策略中建立了以下两种策略。 1。凋亡有多种路线，不足以抑制一条路线。因此，我们旨在多次同时表达凋亡抑制基因，并对“ Bcl-2和P35”以及“ Bcl-2和Bag-1”共存电流库存产生共表达。如预期的那样，这些表现出抗凋亡的抗性。另一方面，这些菌株略有下降。正如预期的那样，所有这些都耐受细胞死亡，即使在低氧气环境中，这是人造肝脏中的一个问题，并且肝功能仍在继续。 2。仅抗态度抗性不足以改善人造肝的功能。因此，除了抗凋亡的基因BCl-2外，我们还旨在创建与肝功能相关的基因表达过多。具体而言，去除氨的肝功能很重要，因此引入了谷氨酰胺合成酶（GS）基因。 GS是一种从谷氨酸和氨中合成谷氨酰胺的酶。引入GS基因后，大约六个月的基因扩增导致氨去除能力接近五次，并且已经建立了巨大的库存。在该细胞中，凋亡抑制基因Bcl-2的表达略有降低。 GS的使用首先由大阪大学的Daisho进行，并在这项研究中与大政府合作进行。我们希望在以上整个过程中建立的新细胞将有助于改善杂交人工肝功能。

项目成果

寺田 聡: "絹タンパク質セリシンの動物細胞培養への有効性"バイオサイエンスとインダストリー. 60・10. 683-684 (2002)

寺田聪：“丝蛋白丝胶对动物细胞培养的功效”《生物科学与工业》60・10（2002）。

A.Ogawa, S.Terada, Y.Saito, T.Kimura, A.Yamaguchi, M.Miki: "Establishment of novel anti-apoptotic insulin-producing cell lines for diabetes cell therapy"Biochemical Engineering Journal. (印刷中).

A.Okawa、S.Terada、Y.Saito、T.Kimura、A.Yamaguchi、M.Miki：“用于糖尿病细胞治疗的新型抗凋亡胰岛素生成细胞系的建立”《生物化学工程杂志》（正在出版）。

日本生物工学会セル&ティッシュエンジニアリング研究部会(共著): "「バイオミメティック組織デバイス」-開発の現状と将来展望-(ISBN 4-88361-210-4 C3060)"(株)三恵社(印刷中).

日本生物工程学会细胞组织工程研究小组委员会（共同作者）：“‘仿生组织装置’-发展现状和未来前景-（ISBN 4-88361-210-4 C3060）”三溪社有限公司（在新闻） 。

A.Ogawa, S.Terada, N.Sakuragawa, M.Nagao, M.Miki: "Progesterone, but not 17β-Estradiol, Up-regulates Erythropoietin (EPO) Production in Human Amniotic Epithelial Cells"Journal of Bioscience and Bioengineering. 96. 448-453 (2003)

A.Okawa、S.Terada、N.Sakurakawa、M.Nagao、M.Miki：“黄体酮而非 17β-雌二醇，上调人羊膜上皮细胞中促红细胞生成素 (EPO) 的产生”《生物科学与生物工程杂志》96。 .448-453 (2003)

A.Ogawa, S.Terada, M.Miki, K.Matsuura, A.Hoshika, N.Sakuragawa: "Human Amniotic Epithelial (HAE) Cells Produce Erythropoietin"Animal Cell Technology : Basic & Applied Aspects. 12. 309-313 (2002)

A.Okawa、S.Terada、M.Miki、K.Matsuura、A.Hoshika、N.Sakurakawa：“人类羊膜上皮 (HAE) 细胞产生促红细胞生成素”动物细胞技术：基础