脂質膜に自発的挿入するペプチド分子の動的高次構造と細胞内挙動の解析

自发插入脂膜的肽分子的动态构象和细胞内行为分析

基本信息

批准号：
14780461
负责人：
松原輝彦
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Keio University (2003-2004)The University of Tokushima (2002)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度に同定されたリポソームに結合する配列の最適化を行うため、再度リン脂質/コレステロール(2:1)リボソームに対して親和性選択を行った。12残基および24残基のランダムベプチドライブラリーからファージ提示法を用いて選択したが、ELISAでは有意な親和性を持つクローンを同定できなかった。そこで直接細胞と相互作用するペプチドを同定するため、MKN細胞に対して親和性選択を行った。選択の結果得られたファージをクローン化し、ペプチド配列の向定を行った。クローン化されたファージを蛍光標識し、フローサイトメーターによる解析を行ったところ、3種類のペプチド配列が細胞と相互作用することがわかった。アッセイによる結果から、これらは細胞膜表面の糖鎖および糖鎖関連タンパク質に結合することがわかった。これらのペプチドはリポソームに組み込むか、ミセル化させることで病原性ウイルスの感染阻害活性を有する可能性がある。細胞に相互作用し、薬剤として機能し得る可能性のあるペプチド分子の設計に成功した。また昨年度に報告した亜鉛結合配列との融合により、高次構造を形成し糖脂質に結合するペプチドの設計を行った。亜鉛結合配列と糖脂質結合配列をコードする遺伝子を連結したプラスミドを調製し、ファージライブラリーを作製した。同様にファージ提示法を用いて選択し、亜鉛を保持した状態で糖脂質認識を行うペプチド配列を同定した。これらは亜鉛の有無の条件によって結合活性が異なる。現在この配列のランダム変異を行い、分子進化させる試みを行っている。このペプチドは環境の変化に応じて高次構造を変え、糖脂質との相互作用を変化する「動的な」分子として機能できる可能性がある。

为了优化去年鉴定的脂质体的结合序列，再次对磷脂/胆固醇（2:1）核糖体进行亲和力选择。使用噬菌体展示选择12和24个残基的随机肽文库，但通过ELISA无法鉴定具有显着亲和力的克隆。因此，为了鉴定与细胞直接相互作用的肽，对MKN细胞进行亲和选择。对选择结果获得的噬菌体进行克隆，并确定肽序列。当对克隆的噬菌体进行荧光标记并使用流式细胞仪进行分析时，发现三种类型的肽序列与细胞相互作用。测定结果表明，它们与细胞膜表面的糖链和糖链相关蛋白结合。当这些肽掺入脂质体或胶束化时，可能具有抑制病原病毒感染的活性。我们成功设计了一种与细胞相互作用的肽分子，并且具有作为药物的潜力。我们还设计了一种肽，它形成更高级的结构，并通过与去年报道的锌结合序列融合来与糖脂结合。制备连接有编码锌结合序列和糖脂结合序列的基因的质粒，并构建噬菌体文库。类似地，噬菌体展示用于选择识别糖脂同时保留锌的肽序列。这些物质的结合活性根据锌的存在或不存在而不同。我们目前正在对该序列进行随机突变，以尝试进化该分子。这种肽可以充当“动态”分子，改变其构象并与糖脂相互作用以响应环境的变化。