スライス温度受容ニュ-ロンイオン機構のパッチクランプ法による解析

膜片钳法分析切片热感受神经元离子机制

基本信息

批准号：
02670065
负责人：
小林茂夫
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

12ー15日令ラットより視束前野横断スライスを作成した。ノマルスキ-顕微鏡直視下に、細胞表面を覆う結合織を除去した後、パッチクランプ記録を行った。Ca^<2+>ーfree/Mg^<2+>液でシナプス伝達を遮断し、1次温度受容ニュ-ロンのみから記録した。(1)パッチ電極での細胞外記録で温度受容ニュ-ロンを同定した。(2)温度受容ニュ-ロンからのニスタチンによるwholeーcell記録ニスタチン(100μg/ml)を含むピペットを細胞膜に密着させて、ニスタチンでポア-を形成させてwholeーcell記録を行った。この方法で細胞内2次メッセンジャ-の流出なしにwholeーcell記録が可能となる。(1)電流固定法:電流の注入により、25℃での膜電位をー60mVに維持した。温度を25℃から35℃に上昇させると、温受容ニュ-ロンでは、膜電位が脱分極して発火頻度が上昇した。冷受容ニュ-ロンでは、膜電位が過分極し、発火頻度が低下した。(2)電位固定法:50nMテトロドトキシンでI_<Na>を部分的に抑制し、電位固定下に電流を記録した。(a)温度依存性電流:25℃および35℃で、±50mVのランプ波電位を加え、それぞれの電流電圧曲線を得た。それらの差の電流は、温度感受性を示すチャンネルの電位依存性を示す。反転電位は、温受容ニュ-ロンで約ー40mV、冷受容ニュ-ロンでは、約ー55mVであった。外液のNa^+、K^+、Cl^ーの組成を変え、反転電位の変化を定量した。温受容ニュ-ロンではNa^+が主に関与し、冷受容ニュ-ロンでは、K^+が主に関与していた。それゆえ、温度上昇により、温受容ニュ-ロンでは、主にNa^+透過性が上昇して静止電位が脱分極し、発火頻度が上昇する。また、冷受容ニュ-ロンでは、温度の上昇により、主にK^+透過性が上昇して静止電位が過分極し、発火頻度が低下すると結論された。(b)電位依存性電流:電位固定下に、ー60mVから0mVへのステップ電位を加え、電位依存性Na^+電流(I_<Na>)、遅延整流性K^+電流(I_K)を記録した。温度を25℃から35℃に上昇させると、温・冷受容ニュ-ロンで、電流はいずれも上昇した。I_<Na>、I_Kは、温度受容ニュ-ロン発火頻度の温度依存性に関わらないと結論された。(3)温受容ニュ-ロン温度依存性電流の通常wholeーcell記録温受容ニュ-ロンのニスタチンによるwholeーcell記録の後、同じ細胞の通常のwholeーcell記録を行い、温度依存性電流の変化の有無を検討した。(a)ピペット内液に2mMATPを含むピペットでの通常のwholeーcell記録:この記録法では、温度依存性電流の逆転電位は、ニスタチン法で得た逆転電位に比べ、21.1mV±17.3(n=6)過分極した。(b)ATPを含まないピペットでの通常のwholeーcell記録:この記録法では、温度依存性電流の逆転電位は、ニスタチンで得た逆転電位に比べ、ほとんど変化しなかった(n=3)。それゆえ、細胞内ATPが、温度依存性に過分極を引き起こし、ニスタチンで記録された細胞の温度受容性を変化させるものと結論された。

从12-15日龄的大鼠制备横向视前区切片。去除覆盖细胞表面的结缔组织后，在诺马斯基显微镜的直接观察下进行膜片钳记录。用无Ca 2+ /Mg 2+ 溶液阻断突触传递，并且仅从初级温度感受神经元进行记录。 (1)使用贴片电极通过细胞外记录来识别热敏神经元。 (2)使用来自热敏神经元的制霉菌素进行全细胞记录通过将含有制霉菌素(100μg/ml)的移液器与细胞膜紧密接触并用制霉菌素形成孔来进行全细胞记录。该方法允许全细胞记录而不会泄漏细胞内第二信使。 (1)电流钳法：通过电流注入将25℃下的膜电位维持在-60mV。当温度从25℃升高到35℃时，热感受神经元的膜电位去极化，放电频率增加。在冷受体神经元中，膜电位变得超极化，放电频率降低。 (2)电压钳法：用50nM河豚毒素部分抑制I_<Na>，在电压钳下记录电流。 (a) 温度相关电流：在 25°C 和 35°C 下施加 ±50 mV 的斜波电位，以获得各自的电流-电压曲线。它们的电流差表明了通道的电压依赖性，表现出温度敏感性。温受体神经元的反转电位约为-40 mV，冷受体神经元的反转电位约为-55 mV。我们改变了外部溶液中 Na^+、K^+ 和 Cl^- 的组成，并量化了反转电位的变化。在热受体神经元中，主要涉及Na^+，在冷受体神经元中，主要涉及K^+。因此，温度升高主要增加热感受神经元的 Na^+ 渗透性，使静息电位去极化，并增加放电频率。还得出结论，在冷受体神经元中，温度升高主要增加 K^+ 通透性，使静息电位超极化，并降低放电频率。 (b) 电压相关电流：在固定电位下施加从-60mV到0mV的阶跃电位，记录电压相关的Na^+电流(I_<Na>)和延迟整流器K^+电流(I_K) 。做过。当温度从 25°C 升高到 35°C 时，暖感受器神经元和冷感受器神经元中的电流均增加。结论是I_<Na>和I_K不参与感温神经元放电频率的温度依赖性。 (3)热感受神经元温度依赖性电流的正常全细胞记录用制霉菌素对热感受神经元进行全细胞记录后，对相同细胞进行正常全细胞记录以记录是否存在任何温度依赖性电流。变化。 (a) 使用移液器溶液中含有 2mMATP 的移液器进行常规全细胞记录：在此记录方法中，温度依赖性电流的反转电位为 21.1 mV ± 17.3 (n =6) 超极化。 (b)使用不含ATP的移液管的传统全细胞记录：使用该记录方法，与用制霉菌素获得的反转电位相比，温度依赖性电流的反转电位几乎没有改变(n＝3)。因此得出结论，细胞内 ATP 以温度依赖性方式引起超极化，改变用制霉菌素记录的细胞的热敏感性。