X線結晶構造解析によるゲンジボタルルシフェラーゼの発光色決定機構の解明

通过X射线晶体结构分析阐明源氏萤火虫荧光素酶的发光颜色测定机制

基本信息

批准号：
13760078
负责人：
市山進
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Gakushuin University (2002)The Institute of Physical and Chemical Research (2001)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

ホタルのルシフェラーゼは、ルシフェリンとMgATPおよび酸素を用いて発光反応を触媒する。本触媒反応では、ルシフェリンとMgATPが反応してルシフェリルアデニレート中間体が酵素中で形成され、その酸化によって生じたオキシルシフェリンが励起状態から基底状態に移るときに発光が観測される。本野生型酵素の発光は黄緑色であるが、S286N変異導入により発光色はオレンジ色に変化する。これまでに、発光反応後の酵素の結晶化により酵素-オキシルシフェリン-AMP複合体を捉えることに成功し、本酵素の活性部位を同定している。反応中間体アナログを捉える目的で、本酵素をデヒドロルシフェリン(基質アナログ)およびMgATPと反応させて結晶化することを試み、結晶を得ることができた。しかし、X線解析の結果、デヒドロルシフェリンとAMPが分かれて観測され、中間体アナログを捉えることはできなかった。今回、中間体アナログであるスルファモイルアデノシルデヒドロルシフェリン(SLU)を合成し、これと野生型およびS286N変異酵素との共結晶化をそれぞれ試みた。沈澱剤としてPEG4000を用い、ハンギングドロップ蒸気拡散法によりそれぞれ結晶を得た。SPring-8のビームラインBL45PX、BL44B2で回折強度データを収集し、野生型、変異型酵素に対してそれぞれ1.35、1.45Å分解能の回折強度データを得た。構造解析の結果、いずれの構造でもSLUの電子密度が観測された。しかし、野生型および変異型酵素それぞれの活性中心近傍のアミノ酸残基およびSLUの構造を比較した結果、大きな変化は見出されなかった。活性中心の環境(例えば水素結合ネットワーク)のほんのわずかな違いが発光色変化と関係する可能性が考えられた。

萤火虫荧光素酶使用荧光素，MGATP和氧催化发光反应。在这种催化反应中，荧光素和MGATP反应形成酶中的腺酸腺酸中间体，并且当其氧化从激发态变为基态而产生的氧化含量会变化时，观察到发光。这种野生型酶的发光为黄绿色，但由于引入S286N诱变，发光颜色变为橙色。到目前为止，发光反应后酶的结晶成功捕获了酶 - 氧基蛋白 - AMP复合物，并且已经鉴定出该酶的活性位点。为了捕获反应中间类似物，我们试图通过与脱氢氧蛋白（底物类似物）和MGATP反应来结晶酶，并获得晶体。然而，X射线分析表明，分别观察到脱氢氧蛋白和AMP，无法捕获中间类似物。在本文中，我们合成了中间的类似物磺胺丙酰丙酰丙酰羟基羟基酸蛋白（SLU），并试图将其与野生型和S286N突变酶共结晶。 PEG4000用作脱水剂，并通过悬挂液蒸气扩散获得晶体。在弹簧8束线BL45PX和BL44B2上收集衍射强度数据，分别用于野生型和突变酶为1.35和1.45Å分辨率的衍射强度数据。由于结构分析，观察到两个结构的电子密度。但是，当比较野生型和突变酶的活性中心附近的氨基酸残基和SLU结构时，没有发现重大变化。据认为，活动中心环境（例如氢键网络）只有轻微的差异可能与发光色变化有关。