光合成細菌由来炭酸固定経路である還元的TCA回路の分子生物学的解析

还原 TCA 循环（源自光合细菌的二氧化碳固定途径）的分子生物学分析

基本信息

批准号：
13750735
负责人：
福居俊昭
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

還元的TCA回路は有機酸を代謝系の中心とした非Calvin回路型のCO_2固定系の一つであり、TCA回路の逆回転により4分子のCO_2から1分子のオキサロ酢酸を生成する。しかし、本回路におけるそれぞれの酵素的性質や反応機構の解析、遺伝子クローニングはこれまで詳しく行われていない。本研究は湖水より単離した緑色硫黄細菌Chlorobium limicola由来還元的TCAによるCO_2固定を分子レベルで明らかにすることを目的とした。ATP-citrate lyase(ACL)はATPを用いてクエン酸をオキサロ酢酸とアセチルCoAに開裂する逆クライゼン反応を触媒する興味深い酵素であり、原核生物では還元的TCA回路を有する生物にのみ存在している。我々はC. limicola由来ACL遺伝子のクローニングと異種宿主発現を行い、本酵素が真核生物由来酵素と異なるαβヘテロ構造を有していることを明らかにした。本酵素は逆反応を触媒せず、またADPによる競争阻害や、基質であるクエン酸濃度に応じた負の協同性を示し、回路の回転を制御していることを見出した。また[γ-^<32>P]ATPを用いた反応機構の検討により、本酵素のα-サブユニット中のHis273が自己リン酸化され、ついでリン酸基のクエン酸への転移とCoAとの結合によって生じたシトリル-CoAが開裂してオキサロ酢酸とアセチルCoAが生成することを示した。さらに、ADPは自己リン酸化された酵素と可逆的に反応してATPを再生することにより競争的に酵素反応を阻害することを示した。一方で、本菌ゲノムにはTCA回路の鍵酵素であるcitrate synthase(CS)の相同遺伝子が存在することを見いだした。CSは還元的TCA回路によるCO_2固定を阻害すると予想されることから、その発現および発現産物について検討した。本遺伝子産物は大腸菌由来CSと45%の相同性を示し、その組換え型酵素は確かにCS活性を示した。さらに本菌において本遺伝子が転写・翻訳されていることを見いだした。酵素的性質について検討したところ、本酵素はAMPおよびADPによって強く活性化されたことから、細胞内のエネルギー状態に応じた還元的TCA回路/TCA回路の方向や速度の調節に機能していることが推測された。また、CO_2固定酵素の一つであるisocitrate dehydrogenaseの遺伝子クローニングおよび生化学的解析を行った。本酵素は、多くの生物に存在するダイマー型とは異なるモノマー型酵素であり、中性付近では脱炭酸活性と同程度の炭酸固定活性を示すこと、オキサロ酢酸によって競争阻害を受けることを明らかとした。

还原性TCA电路是具有有机酸作为代谢系统中心的非加尔文电路型CO_2固定系统之一，通过TCA回路的反向旋转，从四个分子CO_2产生了一种草乙酸的分子。但是，尚未详细进行对每个电路和基因克隆的酶特性和反应机制的分析。这项研究旨在通过从湖水中分离出的绿色硫细菌叶绿素的绿硫细菌叶绿素叶绿素中的还原性TCA来阐明CO_2固定在分子水平上。 ATP-柠檬酸裂解酶（ACL）是一种有趣的酶，可催化反向粘土反应，使用ATP将柠檬酸裂解为草乙酸和乙酰辅酶A，并且仅存在于具有还原性TCA循环的生物体中的原核生物中。我们克隆了C. limicola衍生的ACL基因并将其表达在异源宿主中，表明该酶具有与真核生物衍生的酶不同的αβ异质结构。发现该酶不会催化反向反应，并且还显示出对ADP诱导的竞争和柠檬酸浓度（即底物）的响应，并控制电路的旋转。此外，通过使用[γ-^<32> p] ATP检查反应机制，表明该酶的α-亚基中的HIS273自动磷酸化，并且通过将磷酸盐酸转移到柠檬酸转移到柠檬酸并与coA裂解，从而导致氧化和氧化剂的形成和氧化剂。此外，已经表明，ADP通过与自磷酸化的酶反应以再生ATP来竞争性抑制酶促反应。另一方面，发现该细菌的基因组具有柠檬酸酸合酶（CS）的同源基因，这是TCA循环中的关键酶。由于预计CS会通过还原性TCA周期抑制CO_2固定，因此检查其表达产物和表达产物。该基因产物与E. coli衍生的CS表现出45％的同源性，其重组酶无疑显示出CS活性。此外，发现该基因在该细菌中被转录和翻译。在检查酶特性时，估计该酶被AMP和ADP强烈激活，因此它可以根据细胞内的能量状态调节还原性TCA/TCA电路的方向和速度。此外，进行了基因克隆和生化分析，对Isocitrate脱氢酶（CO_2固定酶之一）进行了。该酶是一种与许多生物体中存在的二聚体类型不同的单体酶，并且已经发现它表现出类似于中性附近脱碳活性的碳固定活性，并且被黄核酸竞争性抑制。