小脳形成に関わるチロシンリン酸化タンパク質群のプロテオーム解析

参与小脑形成的酪氨酸磷酸化蛋白的蛋白质组分析

• 批准号: 13780618
• 负责人: 田岡 万悟
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780618/
• 关键词: Mass spectrometry; Liquid chromatography

チロシンリン酸化タンパク質の小脳のステージごとの変化を解析するためには、同定される各タンパク質の定量的なデータを取得した後に、それらを網羅的に比較をする必要があると考えられた。そこで、チロシンリン酸化タンパク質(ペプチド)の同位体希釈法による定量解析について、モデルタンパク質を利用して評価検討した。モデルタンパク質はリジルエンドペプチダーゼで限定的に分解し、生じたペプチドのアミノ末端とリジンのアミノ基を、同位体標識した新規試薬で修飾した。修飾効率は、アミノ末端よりもリジンアミノ基の方が高く、アミノ末端はほとんど修飾されなかった。異なった同位体によって標識されたペプチドは混合後、LC-ESI/TOFMSで分析され、タンデムMS法によって同定された。同定されたペプチドの定量は、スペクトルから得られるそれぞれの同位体MSシグナルの強度比を比較することで行った。定量では2桁程度の直線性が見られ、半定量するにあたって、十分な直線性を持っていると考えられた。一方、チロシンリン酸化タンパク質を回収するための抗チロシンリン酸化抗体を利用した回収方法については検討中である。

为了分析酪氨酸磷酸化蛋白的小脑阶段的变化，人们认为必须获得每种蛋白质的定量数据，然后对其进行全面比较。因此，使用同位素稀释剂对酪氨酸磷酸化蛋白（肽）进行定量分析，并使用模型蛋白进行了检查。用赖氨酸内肽酶降解模型蛋白，并用一种​​新型的同位素标记的试剂修饰所得肽的氨基末端和赖氨酸氨基。赖氨酸氨基组的修饰效率高于氨基末端，而在氨基末端几乎没有修改。混合用不同同位素标记的肽通过LC-ESI/TOFM进行分析，并通过串联MS方法鉴定。通过比较从光谱获得的每个同位素MS信号的强度比进行定量进行定量。定量测定显示线性约为两个数量级，被认为具有足够的线性来进行半定量测定。另一方面，目前正在考虑使用抗酪氨酸磷酸化抗体来恢复酪氨酸磷酸化蛋白的恢复方法。

项目成果

田岡 万悟: "細胞内機能性複合体解析のためのタンパク質大規模解析システム"実験医学. 20(1). 8-12 (2002)

Mango Taika：“用于分析细胞内功能复合物的大规模蛋白质分析系统”实验医学20(1)。