突然変異mtDNAを用いたミトコンドリア間機能的相互作用の証明

使用突变体 mtDNA 演示线粒体之间的功能相互作用

基本信息

批准号：
13780566
负责人：
中田和人
金额：
$ 1.54万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は、ミトコンドリア間の相互作用にはミトコンドリア同士の融合が必須であることを作業仮説とし、ミトコンドリア融合因子(Fzo:2つのアイソフォームが存在し、それぞれをFzo1,Fzo2とする)がミトコンドリア間相互作用に与える影響について検証した。まず、ミトコンドリア間相互作用を検証するためモデル細胞として、mtDNAに異なる点突然変異を持ったヒト培養細胞(mtDNA3243番点突然変異とmtDNA4269番点突然変異をそれぞれ導入した2つの細胞株)を樹立し、それぞれの細胞におけるFzo1とFzo2の発現量をRT-PCRによって比較した。その結果、両細胞におけるFzoアイソフォームの発現量に違いは見られなかった。また、突然変異型mtDNAを含まないヒト培養細胞と比較しても、その発現量に大きな違いは見られなかった。これらの結果は、ミトコンドリア呼吸機能の異常に関わらず、細胞内のミトコンドリアは活発に融合していることを示唆している。次に、mtDNA3243番点突然変異とmtDNA4269番点突然変異をそれぞれ導入した2つの細胞株を融合させ、ハイブリット細胞を得た。このハイブリッド細胞の細胞質では、ミトコンドリア融合を介して機能を失っていた遺伝産物を交換できるため、おのおのの突然変異によって消失していた呼吸活性が回復する。この時のミトコンドリアの微細形態を観察すると、ミトコンドリア間で連結した構造が観察された。これは、ミトコンドリアの融合はエンドサイトーシスやエクソサイトーシスのような大規模な膜融合ではなく、連結構造を発達させ、遺伝子産物を交換している可能性を示唆している。現在、このような構造にFzo1とFzo2が特異的に局在しているか否か、さらに、Fzo1とFzo2をノックダウンしたハイブリッド細胞を作製し、ミトコンドリア呼吸機能の回復を阻害できるか否かを検討している。

今年，我们使用了线粒体融合因子（FZO：两种同工型，每种都有FZO1和FZO2）对线粒体相互作用的工作假设，并检查了线粒体融合因子对线粒体相互作用的影响。首先，为了验证线粒体的相互作用，在mtDNA中具有不同点突变的人培养细胞（引入MTDNA点突变3243和mtDNA点突变4269点突变的两个细胞系被作为模型细胞建立，并比较了每个细胞中FZO1和FZO2的表达水平。结果，在两个细胞的FZO同工型表达水平上均未发现差异。此外，与不包含突变体mtDNA的人类培养细胞相比，表达水平没有观察到显着差异。这些结果表明，尽管线粒体呼吸功能异常，但细胞内线粒体仍被积极融合。接下来，将两种已引入MTDNA3243和MTDNA4269突变的细胞系被融合以获得杂交细胞。在该杂交细胞的细胞质中，可以通过线粒体融合交换失去功能的遗传产物，并且由于每种突变而消失的呼吸活性被恢复。当此时观察到线粒体的微态性时，观察到线粒体之间的结构。这表明线粒体融合可能会形成连锁结构和交换基因产物，而不是大规模的膜融合，例如内吞作用和胞吐作用。目前，我们正在研究FZO1和FZO2是否特异性地定位于这种结构中，并且是否可以产生撞击FZO1和FZO2的混合细胞以抑制线粒体呼吸功能的恢复。