糸状菌アンモニア発酵の分子機構解明

丝状真菌氨发酵分子机制的阐明

基本信息

批准号：
13306008
负责人：
祥雲弘文
金额：
$ 26.29万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

Fusarium oxysporumなど、多くの土壌真菌(糸状菌)がアンモニア発酵を行うことを示した。F.oxysporumの代謝系について詳細な検討を加え、以下のように、その機構を分子レベルで明らかにした。エタノールなどの炭素源は酢酸に酸化され、その過程上acetate kinaseのステップで基質レベルのリン酸化が行われ、嫌気的成育に寄与することが示された。その間生じた電子はNADまたはNADP経由で硝酸に捨てられ、アンモニアを生じることが判明した。硝酸塩は亜硝酸経由でアンモニアへ還元され、そこに関わる硝酸塩還元酵素、亜硝酸塩還元酵素は脱窒系の酵素とは異なり、同化型の各酵素と同じものが使われている可能性の高いことが示された。通気の影響を見ると、アンモニア発酵は全く通気を行わないような嫌気条件でもっとも活性が高く、その際の電顕観察によるミトコンドリアの形態は中身の希薄な不完全なものであった。硝酸塩存在下での微好気条件ではアンモニア発酵は脱窒に置き換わり、それに伴い形態的に完全なミトコンドリアが形成された。すなわち、アンモニア発酵は細胞質で、脱窒はミトコンドリアで行われることをさらに支持する結果を得た。さらに通気の高い好気条件では両者とも抑制され、エネルギー産生は酸素呼吸によることが示された。以上の結果は、従来好気的生物と考えられていた土壌真菌の多くが実は、嫌気、微好気、好気の3段階もの通気条件に細やかに適応できる通性嫌気性菌であることを初めて明らかにしたものである。F.oxysporumのP450nor遺伝子上流のプロモーター領域の解析を行い、低酸素および硝酸イオンの検知にそれぞれ関わるシス因子を特定した。アンモニア発酵に関わる遺伝子の同領域との比較は興味深い。さらに、硝酸還元系(硝酸塩還元酵素、亜硝酸塩還元酵素)がアンモニア発酵と脱窒で異なることを遺伝子レベルで証明した。

我们发现许多土壤真菌（丝状真菌），例如尖镰孢，可以进行氨发酵。我们对尖孢镰刀菌的代谢系统进行了详细的研究，并在分子水平上阐明了其机制，如下所示。结果表明，乙醇等碳源被氧化为乙酸，在此过程中，在乙酸激酶步骤中发生底物水平的磷酸化，这有助于厌氧生长。结果发现，在此期间产生的电子通过NAD或NADP被丢弃到硝酸中，产生氨。硝酸盐通过亚硝酸盐还原为氨，并且参与该过程的硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶与反硝化酶不同，并且可能与合成代谢酶相同。从通气的影响来看，氨发酵在完全没有通气的厌氧条件下最为活跃，而且当时的电镜显示线粒体形态不完整，内容物稀薄。在硝酸盐存在的微氧条件下，氨发酵被反硝化取代，从而形成形态完整的线粒体。换句话说，结果进一步支持氨发酵发生在细胞质中，反硝化发生在线粒体中。此外，在高通风的有氧条件下，两者都受到抑制，表明能量的产生是由于氧气呼吸。上述结果表明，许多传统上被认为是好氧生物的土壤真菌实际上是兼性厌氧生物，可以很好地适应厌氧、微需氧和好氧三种级别的通气条件，这是首次被揭示。我们分析了尖孢镰刀菌 P450nor 基因上游的启动子区域，并鉴定了参与缺氧和硝酸根离子检测的顺式元件。将该区域与参与氨发酵的基因进行比较是很有趣的。此外，我们在基因水平上证明了氨发酵和反硝化的硝酸盐还原系统（硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶）是不同的。