C型肝炎ウイルスワクチン開発のためのCD81の構造生物学的研究

CD81用于丙型肝炎病毒疫苗开发的结构生物学研究

• 批准号: 13226056
• 负责人: 北所 健悟
• 金额: --
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13226056/
• 关键词: C型肝炎ウイルス; 膜4階貫通型タンパク質Tetrasapnin; CD81タンパク質; X線構造解析; ウイルスレセプター; ワクチン開発; タンパク質結晶化; HCV結合部位; C型肝炎ウイルス; 膜4階貫通型タンパク質Tetrasapnin; CD81タンパク質; X線構造解析; ウイルスレセプター; ワクチン開発; タンパク質結晶化; HCV結合部位

C型肝炎ウイルスレセプターであるCD81タンパク質のメジャー細胞外ドメインであるLELタンパク質(CD81-LEL)とペプチド性の阻害剤を共結晶させた外形並びに結晶学的データが全く異なる新規な結晶についてSPring-8において2.6Å分解能のデータ測定を行い、この回折強度データと既に構造解析を整えたNativeの立体構造を基に、分子置換法の手法を用いて立体構造を決定した。その結果、阻害剤部分の電子密度については観測することはできなかったが、新たな結晶系においては、その立体講造が大きく変化していることが判った。その部位は、とりわけHCVが結合すると考えられるheadサブドメインであり、HCVの結合に重要であるPhe186残基の周辺が大きく変化していることが判った。その結果、2つの結晶系におけるCD81-LELの立体構造決定により、4つの可能なコンフォーメーションを得ることができた。2量体の形成に関与するStalkサブドメインは、立体構造が保持されていることから生体内においてもCD81が2量体として存在することを示唆している。一方、HCVの結合に関与するHeadサブドメインは、立体構造の柔軟さが観測された。HCV-E2蛋白質の結合に必須であるPhe186残基並びにその周辺の疎水性アミノ酸からなる疎水性クラスターは溶媒側に突出して存在し、いずれの構造においても、結晶内で他の対称な分子とパッキングしていた。従って、この領域がHCVとの相互作用に関与する部位であると考察できる。また、CD81-LELタンパク質の発現精製を行い、もう一つのCD81の細胞外ドメインであるSELタンパク質(Small Extracellular Loop)との複合体の共結晶化実験を試みた。SELタンパク質はLELと共存することにより、HCV結合の活性を促進することがわかっている。このことより、CD81のLEL/SELの全細胞外ドメインの立体構造決定は、HCVワクチン開発を考える上で重要であると考えられる。共結晶化スクリーニングの結果、新たな結晶形を有するLEL/SEL複合体タンパク質結晶を得る事ができた。Spring-8にてX線回折データ測定を行ったところ、2.0A分解能のデータを収集することができ、空間群がC2に属する新規な結晶系に属することがわかった。

对于具有完全不同的晶体学数据的新型晶体，以2.6Å分辨率测量数据，这些晶体是LEL蛋白（CD81-叶子）的共晶体，这是乙型肝炎病毒受体CD81蛋白的主要细胞外结构域，以及与肽抑制剂的新型晶体在Spring-8中的结构，并基于Spring-8的结构，并基于Spring-8的结构。结构分析，使用分子替代方法确定三维结构。结果，尽管无法观察到抑制剂部分的电子密度，但发现新晶体系统的3D发育已经发生了重大变化。除其他外，该部位是被认为与HCV结合的头部子域，发现对与HCV结合很重要的Phe186残基的外围发生了重大变化。结果，通过在两个晶体系统中确定CD81-LEL的三维结构获得了四个可能的构象。与二聚体形成相关的茎亚域表明，由于保留其构象，因此CD81作为体内二聚体存在。另一方面，观察到参与HCV结合的头部子域的三维结构的柔韧性。由PHE186残基组成的疏水簇，对于HCV-E2蛋白的结合至关重要，周围的疏水氨基酸朝向溶剂侧，并在任何结构中突出，并在晶体内包含其他对称分子。因此，可以认为该区域是与HCV相互作用的站点。此外，纯化了CD81-叶子蛋白的表达，并进行了共结晶实验，以执行CD81的另一个细胞外域，即SEL蛋白（小细胞外环）。已经发现SEL蛋白通过与LEL共存来促进HCV结合活性。这表明CD81 LEL/SEL的整个细胞外域的结构确定对于考虑HCV疫苗的发展很重要。由于共结晶屏幕，获得了具有新晶体形式的LEL/SEL复合蛋白晶体。 X射线衍射数据测量在Spring-8中进行，并收集了分辨率为2.0a的数据，发现该空间群属于属于C2的新型晶体系统。