ヘパラナーゼ阻害剤探索系の構築と活性化機構の解析

乙酰肝素酶抑制剂搜索系统构建及激活机制分析

基本信息

批准号：
13218141
负责人：
清水史郎
金额：
$ 4.93万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13218141/
关键词：
ヘパラナーゼヘパラン硫酸 mRNA DNAメチル化プロテインキナーゼC

项目摘要

本年度は、1.ヘパラナーゼ阻害剤探索系の構築、2.構築したアッセイ系を利用した阻害剤の同定、3.ヘパラナーゼmRNAの発現機構の解析、および4.ヘパラナーゼタンパク質の安定化、に関して検討を行った。1.ヘパラナーゼ阻害剤探索系の構築:HepG2細胞にヘパラナーゼ遺伝子を遺伝子導入した細胞を樹立し、その細胞抽出物を酵素源、市販のヘパラン硫酸を基質としてヘパラナーゼ阻害剤探索系の構築を行った。2.構築したアッセイ系を利用した阻害剤の同定:上記アッセイ系を利用して、微生物二次代謝産物を用いたスクリーニングを行った結果,ヘパラナーゼ阻害剤としてRK-682を単離した。RK-682はin vitroにおいて約10μMの濃度でヘパラナーゼ活性を阻害した。また、ケミカル・ライブラリーを用いたスクリーニングでは4つの化合物がヘパラナーゼ阻害活性を示した。3.ヘパラナーゼmRNAの発現機構の解析:ヘパラナーゼの発現は正常組織で低く、がん組織で亢進している。様々な検討を行った結果,DNAのメチル化がヘパラナーゼの発現調節に間接的に関与していることを明らかにした。つまり、正常組織において、ある遺伝子のプロモーター領域がメチル化されているため、結果的にヘパラナーゼの発現が抑えられているが、がん組織においてはこのメチル化の程度が低いためにヘパラナーゼ遺伝子の発現が亢進している可能性が示唆された。4.ヘパラナーゼタンパク質の安定化:様々なタンパク質の安定化に関与しているプロテインキナーゼC(PKC)に着目し,ヘパラナーゼタンパク質の安定化に対する影響を検討した。その結果,PKC活性化剤のTPA処理によりヘパラナーゼタンパク質の安定化が誘導され、PKC阻害剤処理でヘパラナーゼタンパク質の減少が誘導された。

今年，我们研究了1。肝素酶抑制剂搜索系统的构建，2。使用构造测定系统鉴定抑制剂，3。分析肝素酶mRNA表达机制和4。乙酰肝素酶蛋白的稳定。 1。构建肝素酶抑制剂搜索系统：已将肝素酶基因转染的细胞建立到HEPG2细胞中，并使用细胞提取物作为酶源，并将硫酸乙酰肝素作为底物作为底物，肝素酶抑制剂搜索系统构建。 2。使用构造测定系统鉴定抑制剂：上述测定系统用于使用微生物二级代谢产物进行筛查，作为乙酰肝素酶抑制剂RK-682被分离出来。 RK-682在大约10μm的浓度下抑制了肝素酶活性。此外，四种化合物在使用化学文库的筛查中显示出肝素酶抑制活性。 3。分析肝素酶mRNA的表达机制：肝素酶表达在正常组织中较低，并且在癌症组织中增加。各种研究表明，DNA甲基化间接参与肝素酶表达的调节。换句话说，在正常组织中，某个基因的启动子区域是甲基化的，导致乙酰肝素酶表达抑制，但是在癌症组织中，甲基化程度可能很低，因此肝素酶基因的表达可能会增加。 4。肝酶蛋白的稳定：我们专注于蛋白激酶C（PKC），该蛋白激酶C（PKC）参与了稳定各种蛋白质，并研究了对乙酰肝素蛋白稳定的影响。结果，用PKC激活剂治疗诱导肝素酶蛋白的稳定化，并用PKC抑制剂治疗可诱导肝素酶蛋白的降低。