単一アクチンフィラメント直視による重合・脱重合ダイナミクス機構の解明

通过直接观察单个肌动蛋白丝阐明聚合/解聚动力学机制

基本信息

批准号：
01J08663
负责人：
藤原郁子
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J08663/
关键词：
アクチン細胞骨格重合トロポミオシン

项目摘要

アクチンは全ての真核細胞に存在して柔らかい細胞骨格を担うが、フィラメント1本の動的メカニズムは明らかでない。アクチンフィラメント1本の重合・脱重合ダイナミクスのメカニズムを解明するため、純粋なアクチンフィラメント1本の重合過程を直視した結果、アクチンフィラメントは重合相においても定常相においても長さが揺らいでおり、解析から重合・脱重合過程はアクチン分子の結合・解離がフィラメントの両端で確率的に生じる拡散過程とみなせることを明らかにした。更に詳細な解析を行う為、蛍光染色したアクチンフィラメントの一部に集光レーザーを数秒照射し強制退色させ、目印をつける系:フォトブリーチングシステム:を導入した。この実験から、生理的条件下ではアクチンフィラメントには速く重合する端と遅く重合する端があり、どちらの端も時間が経っても殆ど脱重合しないことが観察され、世界に先駆けてトレッドミルを証明することが出来た。この系を利用して、アクチン調節タンパク質トロポミオシン、トロポニンを入れた重合・脱重合過程の直視を行った。この系によって過剰のトロポミオシンを添加するとアクチンフィラメントが束化するバンドル化現象のリアルタイム観察をすることができた(日本生物物理学会名古屋 2002/11)。また、アクチン内部のヌクレオチドがADP-Piであるとき、フィラメントが安定化されることが報告されていることから、本実験系においても無機リン酸Piを添加し、フィラメントの両端での重合・脱重合が穏やかになるかどうかを検討した。(Biophysical Society 46th Anuual Meeting 2003/03 SanAntonio)ついで、東大医科研竹縄研の末次志郎氏との共同研究で、アクチン結合タンパク質であるArp2/3complexによる枝化アクチンフィラメントの重合実験を行った。リアルタイム観察から、Mother filamentのP端寄りに枝が形成されやすいことを示した。また光ピンセット系を用い、Arp2/3complexとVCAの問の破断力が約6pNであることと、ミシンS1から見積られる結合寿命を参考に、Arp2/3complexとVCAの間の結合寿命が100秒であることを示した。

肌动蛋白都存在于所有真核细胞中，并带有软细胞骨架，但单细丝的动态机制尚不清楚。为了阐明一种肌动蛋白细丝的聚合和解聚动力学的机制，我们直接研究了一种纯肌动蛋白丝的过程，结果，肌动蛋白丝的长度在聚合阶段和稳态阶段都波动，并且分析表明，分析是摩尔化的过程，而既定的过程都可以逐渐变化。在细丝的两端概率。为了进行进一步的详细分析，引入了一个光漂白系统，该系统用于照射荧光染色的肌动蛋白丝的部分，并用光收集激光持续几秒钟以迫使褪色，并标记肌动蛋白丝。该实验表明，在生理条件下，肌动蛋白丝具有快速的聚合边缘和缓慢的聚合边缘，并且随着时间的流逝，两端几乎都没有解聚，导致世界上第一个跑步机。使用该系统，我们直接检查了结合肌动蛋白调节的蛋白质肌球蛋白和肌钙蛋白的聚合和解聚过程。该系统允许对捆绑现象的实时观察，其中添加过多的肌动蛋白时肌动蛋白丝被捆绑在一起（Nagoya的生物物理日本社会，2002/11）。此外，据报道，当肌动蛋白内部的核苷酸是ADP-PI时，丝稳定了，因此在该实验系统中，添加了无机PI磷酸盐，以检查丝的两端的聚合和去聚合是否会适度。（生物物理协会第46届ANUAL会议2003/03 Sanantonio）与东京大学Takeawa研究所的Suetsugi Shiro合作，使用肌动蛋白结合蛋白ARP2/3 Complex进行了分支肌动蛋白细丝的聚合实验。实时观察表明，分支往往在母丝的P边缘附近形成。此外，使用光学镊子系统，我们表明ARP2/3 Complex和VCA的破裂力约为6pn，ARP2/3 Complex和VCA之间的键寿命为100秒，指的是从缝纫机S1中估计的键寿命。