ブドウ球菌の二成分性毒素γヘモリジンにおけるヘテロヘプタマー膜孔複合体の形成機構

葡萄球菌二元毒素γ-溶血素异七聚体膜孔复合物的形成机制

• 批准号: 01J08019
• 负责人: 冨田 典子 (菅原 典子)
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J08019/
• 关键词: 黄色ブドウ球菌γヘモリジン; 二成分性溶血毒素; リング状毒素複合体; 膜孔; ヘテロヘプタマー; GST融合Hlg1; GST融合Hlg2; ゴールドラベル

黄色ブドウ球菌γヘモリジンはHlg1(34kDa)とHlg2(32kDa)から成る二成分性溶血毒素である。我々は、γヘモリジンの二成分がヒト赤血球膜上で内径約3nm、外径約9nmのリング状毒素複合体を形成し、この毒素複合体が実効内径約2nmの膜孔として作動し、溶血を引き起こすことを明らかとした。高精細なネガティブ電子顕微鏡像および生化学的な解析結果から、膜孔複合体はヘテロヘプタマーであり、二成分はモル比3:4および4:3で交互に配列していると推定された。本研究では、膜孔複合体中の分子配列を可視化するために、nanogoldでラベルしたグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)を融合させたGST融合Hlg1(またはGST融合Hlg2)とwild typeのHlg2(またはwild typeのHlg1)から成る膜孔複合体を赤血球膜上で形成させ、電子顕微鏡で観察することとした。現在、GST分子内の4個のシステイン残基のうち3個をアラニンに置換し、GST1分子につき1個のGoldでラベルしたGST分子を作成中である。また本毒素複合体は2成分を3:4、4:3で含むために、X線結晶構造解析による3次構造の解明は困難であると予測されるため、電子顕微鏡によるリング状構造体の3次構造の解明を試みた。その結果、複合体は直径約3nmの細長いモノマー分子が平行に並び、複合体の高さ約10nm、横幅約9nmの構造をしていることが判明した。様々な角度から撮影した電子顕微鏡像から、γヘモリジンの腹孔複合体は黄色ブドウ球菌の1成分性溶血毒素αヘモリジンに近似した立体構造を有することが推定された。

金黄色葡萄球菌γ溶血素是一种双组分溶血毒素，由 Hlg1 (34kDa) 和 Hlg2 (32kDa) 组成。我们发现γ-溶血素的两种成分在人红细胞膜上形成内径约3 nm、外径约9 nm的环形毒素复合物，并且这种毒素复合物充当膜孔其有效内径约为2纳米，可防止溶血。根据高分辨率负电镜图像和生化分析结果，推测膜孔复合物是异七聚体，两种组分以3:4和4:3的摩尔比交替排列。在本研究中，为了可视化膜孔复合物中的分子排列，我们使用了与纳米金标记的谷胱甘肽 S-转移酶 (GST) 融合的 GST 融合 Hlg1（或 GST 融合 Hlg2）和野生型 Hlg2（在红细胞膜上形成由Hlg1)组成的膜孔复合物，并使用电子显微镜观察。目前，我们正在创建一种GST分子，其中GST分子中的四个半胱氨酸残基中的三个被丙氨酸取代，并且每个GST分子都被一个金标记。此外，由于该毒素复合物包含比例为3:4和4:3的两种成分，因此预计通过X射线晶体学阐明三级结构是困难的；我们尝试阐明三级结构。结果发现，该复合物具有直径约3nm的细长单体分子平行排列的结构，并且该复合物具有高度约10nm、宽度约9nm的结构。从不同角度拍摄的电子显微照片表明，γ溶血素的腹膜腔复合物具有类似于金黄色葡萄球菌单组分溶血毒素α溶血素的三维结构。

项目成果

Noriko SUGAWARA-TOMITA: "Stochastic Assembly of Two-component Staphylococcalγ-Hemolysin into Heteroheptameric Transmembrane Pores with Alternate Subunit Arrangements in Ratios of 3:4 and 4:3"Journal of Bacteriology. 184・17. 4747-4756 (2002)

Noriko SUGAWARA-TOMITA：“以 3:4 和 4:3 的比例将双组分葡萄球菌 γ-溶血素随机组装到异七聚体跨膜孔中”《细菌学杂志》184・17（2002 年）。

Nishiyama A: "Identification of serine138 residue in the 4-residue segment K135K1361137S138 of LukS-l component of Staphylococcus intermedius leukocidin crucial for the LukS-l-specific function of staphylococcal leukocidin"Biosci Biotechnol Biochem.. 66・2

西山 A：“中间葡萄球菌杀白细胞素 LukS-l 成分的 4 残基片段 K135K1361137S138 中丝氨酸 138 残基的鉴定，对葡萄球菌杀白细胞素的 LukS-l 特异性功能至关重要”Biosci Biotechnol Biochem.. 66・2

Ito, Y.: "Cloning, expression, and cell-surface localization of Paenibacillus sp.W-61 xylanase 5, a multidomain xylanase."Appl.Environ.Microbiol.. 69・12. 6969-6978 (2003)

Ito, Y.：“类芽孢杆菌 sp.W-61 木聚糖酶 5（一种多域木聚糖酶）的克隆、表达和细胞表面定位。”Appl.Environ.Microbiol.. 69・12 (2003)。

菅原典子: "黄色ブドウ球菌γヘモリジンが形成するヘテロヘプタマー膜孔複合体形の構造解析"日本農芸化学会誌. 76・3. 132 (2002)

菅原纪子：“金黄色葡萄球菌γ溶血素形成的异七聚体膜孔复合物的结构分析”日本农业化学学会杂志76, 3. 132 (2002)。