高度好熱菌由来のDNA修復酵素の構造と機能の研究

极端嗜热菌DNA修复酶的结构与功能研究

• 批准号: 01J00809
• 负责人: 山形 敦史
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J00809/
• 关键词: DNA修復; 相同組換え; X線結晶解析; マンガンイオン; エキソヌクレアーゼ; DHHファミリーモチーフ

RecJは相同組換え、塩基除去修復、ミスマッチ修復に関わる、一本鎖DNA特異的なエキソヌクレアーゼである。特に近年、組換えと複製の総合関係に重要な役割を果たすことで注目を集めている酵素である。我々は、高度好熱菌Thermus thermophilus HB8を材料として、そのRecJ遺伝子のクローニング及び発現・精製を行った。我々は前年度までの研究概要報告書に述べたように、このRecJのX線結晶解析に既に成功している。RecJは5つの特徴的なモチーフを持っており、このモチーフを持つ蛋白質群はDHHファミリーとよばれる巨大な蛋白質ファミリーを形成する。我々が明らかにしたRecJの立体構造から、この5つのモチーフのうち4つのモチーフで保存される残基によって、活性に必須なマンガンイオンが配意されていることが分かった。また近年、他グループによって他のDHHファミリー酵素、Family IIのピロリン酸分解酵素の立体構造が明らかにされた。この酵素もまたRecJと同様にDHHファミリーのモチーフ4つでマンガンイオンを配位していた。両酵素の立体構造の重ね合わせにより、これらモチーフが完全に重なり合うことが分かり、DHHファミリーモチーフによる金属結合が高度に保存されていることが示された。ピロリン酸分解酵素の立体構造との比較も考察に入れ、我々はRecJの立体構造からAsp 80,Asp 82,Asp 159,His 161が活性に必須な残基であると予測した。それらはDHHファミリーモチーフに高度に保存されていた。我々はそれらの残基の部位特異的変異体を作り、それらのエキソヌクレアーゼ活性を調べたところ、活性の消失または著しい減少が見られた。これらの結果を基に、RecJの反応機構モデルを提出した。

RECJ是一种参与同源重组，基础切除修复和不匹配修复的单链DNA特异性核酸酶。特别是，近年来，该酶引起了人们的关注，因为它在重组与复制之间的综合关系中起着重要作用。我们使用了高度嗜热细菌嗜热HB8作为克隆，表达和纯化RECJ基因的材料。正如上一年的研究摘要报告中提到的那样，我们已经成功地完成了此RECJ的X射线晶体学。 RECJ具有五个独特的基序，并且携带该基序的蛋白质形成了一个巨大的蛋白质家族，称为DHH家族。我们已经揭示了RECJ的三维结构，我们透露，这五个基序中的四个中保守的残基为其活性提供了必不可少的锰离子。近年来，其他群体揭示了其他DHH家族酶的三维结构，即家族的焦磷酸降解酶II。这种酶，例如RECJ，具有四个DHH家族图案的协调锰离子。两种酶的三维结构的重叠表明，这些基序是完美重叠的，表明DHH家族基序的金属键是高度保守的。我们还研究了与焦磷酸降解酶构象的比较，并预测ASP 80，ASP 82，ASP 159和他的161是RECJ构象中活性的必不可少的残基。他们在DHH家族图案中是高度保守的。我们创建了这些残基的位置定向突变体，并检查了它们的外切酶活性，并发现活性损失或显着降低。基于这些结果，我们提交了RECJ反应机制的模型。

项目成果

山形 敦史: "The crystal structure of exonuclease RecJ bound to Mn^<2+> ion suggests how its characteristic motifs are involved in exonuclease activity"Proceeding of National Academy of Sciences, U.S.A. 99. 5908-5912 (2002)

Atsushi Yamagata：“核酸外切酶 RecJ 与 Mn^2+ 离子结合的晶体结构表明其特征基序如何参与核酸外切酶活性”Proceeding of National Academy of Sciences, U.S.A. 99. 5908-5912 (2002)