草原性植物根に共生するVA菌根菌のDNAマーカーによる直接同定法の確立

草原植物根部共存VA菌根真菌DNA标记直接鉴定方法的建立

基本信息

批准号：
12876057
负责人：
菅原和夫
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12876057/
关键词：
VA菌根 PCR 18SrDNA 種同定 PCRプライマー系統解析 DNAマー Glomales目 18S rDNA DNAマーカー DNA抽出

项目摘要

昨年までの研究によりVA菌根菌からのDNA抽出法としてはボイル法が有効であること、またPCR増幅法としてnested PCRが有効であることを明らかとした。しかし、野外植物に感染するVA菌根菌をPCRで検出・同定するには、既存のVA菌根菌特異的プライマーでは限界があることが確認された。そこで本年度はDNAデータベース検索により、新たなVA菌根菌特異的プライマーの作出を試みた。また同時に、増幅したDNA断片の塩基配列をもとに系統解析を行い感染菌の同定を試みた。材料として野草地から採取したススキ菌根およびシバ菌根を用いた。Nested PCRに適したVA菌根菌特異的プライマーとしてMycF-MycRおよびAMF・AMRプライマーを設計した。Nested PCR後、増幅産物をサブクローニングし、タイプ分けのため6種の制限酵素にてPCR-RFLP解析を行った。247クローンについて解析した結果、57種類のRFLPパターンを得た。各RFLPパターンごとに塩基配列を決定し系統解析したところ、67クローン中64クローンがアーバスキュラー菌根菌の系統に属していることが確認され、プライマーの特異性の高さが示された。また、VA菌根菌系統はいくつかのグループから成ることが確認され、これら一連の方法により感染菌の詳細な分類群レベルの検出が可能となった。さらに、これらのグループを識別する制限酵素の組み合わせとしてMboI, Hsp92II, HpyCH4IVが有効であることが示され、感染菌構成の迅速な定量化が可能となった。以上、一連の研究により根中のVA菌根菌構成を詳細な分類群レベルでかつ定量的に解析することが可能となった。今後、野外のVA菌根菌研究への応用が期待される。

直到去年的研究表明，该沸腾方法可有效从VA菌根真菌中提取DNA，并且嵌套的PCR对于PCR扩增方法有效。但是，已经证实，现有的VA菌根真菌特异性引物的检测和鉴定有限，可以通过PCR感染室外植物的VA Mycorrhizal真菌。因此，今年我们试图通过搜索DNA数据库来创建新的VA Mycorrhizal真菌特异性引物。同时，根据扩增的DNA片段的基础序列进行系统发育分析，以鉴定受感染的细菌。使用的材料是从野生草原收集的菌根菌根和菌根菌根。 MYCF-MYCR和AMF-AMR引物的设计为适合嵌套PCR的VA菌根真菌特异性引物。嵌套PCR后，将扩增产物亚克隆，并使用六种限制酶进行键入进行PCR-RFLP分析。对247个克隆的分析给出了57种不同的RFLP模式。确定了每个RFLP模式的基本序列，系统发育分析表明，67个克隆中有64个属于羊膜菌根真菌谱系，表明引物的特异性很高。此外，已经证实，VA菌根真菌菌株由几组组成，这些系列方法允许详细检测被感染细菌的分类群。此外，MBOI，HSP92II和HPYCH4IV已被证明是有效的，可以作为限制酶组合，鉴定这些基团，从而可以快速定量传染性细菌组成。这一系列的研究使得可以定量分析分类单元中根部的菌根真菌的组成。预计将来将应用于现场菌根真菌。