関連蛋白群の機能解析による造血器腫瘍の染色体転座発生機能の解明

通过相关蛋白组的功能分析阐明染色体易位在造血肿瘤中的功能

基本信息

批准号：
12213029
负责人：
青木克己
金额：
$ 1.92万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12213029/
关键词：
染色体転座 DNA結合蛋白造血器腫瘍

项目摘要

造血器腫瘍にはしばしば染色体転座が認められ、それに起因する遺伝子変化が癌化の直接の原因となっているが、その転座自体の生じる機構に関しては、未だ不明な点が多く残されている。我々はこれまでに転座の発生に関与する可能性を秘めた新規因子を単離し、Translinと命名した。しかしこの蛋白は、種々の解析によっても、生体内での生理活性や染色体転座機構への関与の詳細は未だ不明のままである。我々はその解決のために、マウスのTranslin遺伝子を単離し、そのcDNAとゲノムDNAの構造と塩基配列を調べつのエクソンと5つのイントロンよりなることを解明した。さらに、このゲノム構造と詳細なその制限酵素地図を基にして、相同組換えにより目的の遺伝子を欠損させるためのTarget Vectorを、遺伝子工学的手法を用いて作成した。これをマウスのES細胞にElectoroporationにより形質導入し、同時に組み込まれたNeo耐性遺伝子を利用して、Neomycin(G418)で選別を行った。生き残ったクローンを培養し、増殖してきた段階でゲノムDNAを抽出した後、適切な制限酵素とプローブを用いサザンブロットを行った。この結果、目的とする遺伝子領域が相同組換えを起こしたと思われる1クローンを選別した。得られた組換えクローンを増殖させて一部凍結保存した後、その一部をマイクロインジェクション法により、借り親の卵細胞に注入し融合させた。現在は、生まれ出たキメラマウス(体毛で識別)の中で、生殖細胞において目的とする遺伝子が欠失しているマウスを選別中である。今後は、このキメラマウスと別のマウスと交配し、F1マウスを作成する。次に目的の遺伝子が欠失しているマウスを選びだし、これらのマウス同士でさらに交配してF2をつくり、その中から産まれてくるKOマウスを選別し、解析を行う予定である。

造血系统肿瘤中经常观察到染色体易位，由此产生的基因变化是癌变的直接原因，但关于易位本身发生的机制仍存在许多未知。迄今为止，我们已经分离出一种可能参与易位发生的新因子，并将其命名为Translin。然而，尽管对该蛋白进行了各种分析，但其体内生理活性及其参与染色体易位机制的细节仍不清楚。为了解决这个问题，我们分离了小鼠Translin基因，并检查了其cDNA和基因组DNA的结构和核苷酸序列，揭示了它由1个外显子和5个内含子组成。此外，基于该基因组结构及其详细的限制酶图谱，利用基因工程技术创建了用于通过同源重组删除目标基因的目标载体。通过电穿孔将其转导至小鼠ES细胞中，并使用同时整合的Neo抗性基因用新霉素（G418）进行选择。培养存活的克隆，在它们生长后，提取基因组 DNA，并使用适当的限制性酶和探针进行 Southern 印迹。结果，选择了一个似乎在靶基因区域中经历了同源重组的克隆。将获得的重组克隆增殖并部分冷冻保存后，利用显微注射法将部分克隆注入借用亲本的卵细胞中并使其融合。目前，我们正在选择生殖细胞中缺乏所需基因的嵌合小鼠（通过体毛来识别）。未来，这种嵌合小鼠将与另一只小鼠杂交，产生F1小鼠。接下来，他们计划选择缺乏感兴趣基因的小鼠，将这些小鼠相互杂交以产生F2小鼠，并选择从这些小鼠中诞生的KO小鼠进行分析。