軸索伸長抑制因子Nogoの受容体同定とセマフォリンの細胞内情報伝達系の解明

轴突生长抑制剂 Nogo 受体的鉴定和信号蛋白细胞内信号转导系统的阐明

基本信息

批准号：
12210124
负责人：
中村史雄
金额：
--
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Nogo受容体の性質:当初試みたパニング法ではNogo結合蛋白質は得られなかったが、アルカリホスファターゼ(AP)とNogo細胞外領域との融合蛋白質(APNext)をプローブに用いると、マウス胎仔17日大脳皮質由来の培養神経細胞に結合を認めた。別グループによりAPとNogoの融合蛋白質を用いた同様の手法でGPIアンカー型の膜蛋白質がNogo受容体として報告された。この受容体はAPNextにKd=7nM程度の親和性を持つ。しかしGPI部分を取りAP融合にした受容体はNogo全長を発現させたCOS-7細胞には結合しない。このように同定された受容体とリガンドとの関係はまだ明確でない。いくつかのクラス3セマフォリン(3A,3E)はC末端にある塩基性アミノ酸に富む領域を介してKd=30nM程度の親和性でこのNogo受容体に結合する。従ってこの受容体は抑制シグナルに対する共通の結合蛋白質である可能性が示唆された。Semaphorin受容体の情報伝達の検討:クラス3セマフォリンはNeuropilinとPlexinの複合体を介して成長円錐の退縮反応を引き起こす。LAR型チロシンホスファターゼ(PTPase)が関与する可能性を検討した。LAR型PTPaseに属するLAR,PTPδ,PTPσすべてがSema3A受容体であるNeuropilin-1やPlexin-A1と複合体を形成した。そしてPTPaseの細胞内領域を欠いた変異体でも複合体を形成することから、細胞外領域での相互作用と考えられた。このPTPase欠失変異体をニワトリ胚7日齢の脊髄後根神経節細胞(DRG)に発現させると、PTPδ変異体のみがSema3Aによる退縮反応を部分的に阻害した。さらにホスファターゼ部位を不活化したPTPδ変異体にも同様の抑制効果が認められた。これはLAR型PTPaseのうちPTPδがホスファターゼ活性を介してSema3Aの情報伝達機構に関与していることを示唆する。チロシンキナーゼのfynが欠失した変異マウスのDRGで部分的にSema3A応答が低下していた。HEK293T細胞ではfynはPlexin-A2をリン酸化した。そのリン酸化はNeuropilin-1との共発現により増加した。

NoGo受体的特性：尽管没有初始平培法获得NoGo结合蛋白，但是当碱性磷酸酶（AP）和Nogo细胞外区域融合蛋白（APNEXT）用作探针时，将其作为探针的结合，与培养的神经元相结合，该培养的神经元在塞里布拉尔皮质中衍生在塞雷布拉尔皮质中，占据了17天。在另一组中，使用AP和NoGo融合蛋白使用相同的方法报告了GPI锚定的膜蛋白作为NOGO受体。该受体对apnext的亲和力约为kd = 7nm。但是，服用GPI部分和AP融合的受体不与表达全长Nogo的COS-7细胞结合。以这种方式识别的受体与配体之间的关系尚不清楚。几个3类词素（3A，3E）与该NOGO受体结合，其亲和力约为kd = 30 nm，通过富含碱性氨基酸的区域在C末端。这表明该受体可能是抑制信号的常见结合蛋白。信号受体的信号传导研究：3类信号素通过神经蛋白和丛蛋白复合物触发生长锥的撤回反应。研究了涉及的law型酪氨酸磷酸酶（PTPase）的可能性。属于LAR型PTPase的LAR，PTPδ和PTPσ都与Sema3a受体Neuropilin-1和Plexin-A1形成复合物。此外，由于即使在缺乏PTPase细胞内区域的突变体中也会形成复合物，因此被认为它们是细胞外区域的相互作用。当该PTPase缺失突变体在鸡胚胎中7天大的背根神经节细胞（DRG）中表达时，只有PTPΔ突变体部分抑制SEMA3A的回缩响应。此外，在灭活磷酸酶部位的PTPδ突变体中观察到了相似的抑制作用。这表明，在LAR型PTPase中，PTPδ通过磷酸酶活性参与SEMA3A的信号传导机制。 Fyn的酪氨酸激酶缺失的突变小鼠的DRG部分降低了SEMA3A反应。在HEK293T细胞中，FYN磷酸化plexin-A2。通过与Neuropilin-1共表达，其磷酸化增加了。