人工タンパク質の理論設計と合成

人工蛋白质的理论设计与合成

基本信息

批准号：
12042255
负责人：
高田彰二
金额：
$ 2.56万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

本プロジェクトでは、理論モデルに基づいて人工タンパク質を設計し、それを実際に生合成し、その立体構造や折れたたみ反応の熱力学的および速度論的解析を行う。その結果を理論にフィードバックさせることにより理論モデルを改良する。理論家と実験家の共同によりこのサイクルを繰り返し、それを通じてタンパク質の立体構造を形作っている物理化学的な原理を理解するとともに、新規な人工タンパク質を造ることを目指した。【配列設計の結果】モンテカルロアニーリングシミュレーションによって、Zスコアを最小にする配列を探した。設計と折りたたみの繰り返しによる変性状態構造アンサンブルの構築とZスコアの改良によって設計された配列は高いフォールド能力を持ち、Target構造との相同性を高めている。エネルギーランドスケープを見ると、Target構造との相同性(Q値、Q値が大きい程Target構造に近い)が高い程エネルギーが低くなっており、このデザイン配列の高いフォールド能力を示唆している。上の方法を用いてDHB01からDHB20までの配列を設計した。【人工設計タンパク質の合成実験】設計されたアミノ酸配列が実際に立体構造をとっているかどうかを調べるために、この20種のうち、cavity体積などのスコアから評価した上位3種(DHβ06、DHB09、DHB19)を選択しペプチド合成機を用いて化学合成を行い、その構造安定性をCD(円二色性)、NMR(核磁気共鳴)の手法を用いて調べた。far UV領域でのCD測定においてDHB09、DHB19の2種はランダムコイル状のスペクトルであったが、DHB06は典型的なα-ヘリックス様のスペクトルを示した。DHB06の温度に対する安定性を調べたところ90℃において完全変性し、かつこの変性が可逆であることが分かった。そこで、Native-Denatured間の二状態転移モデルで波長222nmにおけるCD値の熱変性曲線のcurve-fittingを行った結果、エンタルピー変化25kcal/mo1および転移中点温度79℃を得た。これは、野性型の値(ΔH=20kcal/mo1、Tm=80℃)に匹敵する値である。一方、1H-NMR測定によるとDHB09やDHB19の一次元NMRスペクトルは、アミノ酸由来のシャープな様相を呈した。対照的にDHB06のスペクトルでは高磁場シフトしたメチル基や低磁場シフトしたヒスチジン残基のピークなど、DHB06が三次構造を持つことが示唆された。この結果は、天然状態様の三次構造を持つ配列設計の成功を示している。

在这个项目中，我们将基于理论模型设计人工蛋白质，实际生物合成它们，并从热力学和动力学角度分析它们的三维结构和折叠反应。通过将结果反馈到理论中来改进理论模型。通过与理论家和实验家合作重复这个循环，我们的目标是了解形成蛋白质三维结构的物理化学原理并创造新的人造蛋白质。 [序列设计的结果] 我们通过蒙特卡罗退火模拟寻找最小化Z分数的序列。通过重复设计和折叠构建变性态结构整体并提高Z-score所设计的序列具有较高的折叠能力并增加与目标结构的同源性。从能量图来看，与Target结构的同源性越高（Q值越高，越接近Target结构），能量越低，表明该设计序列具有较高的折叠能力。使用上述方法设计了从DHB01到DHB20的序列。 [人工设计蛋白质的合成实验] 为了研究设计的氨基酸序列是否确实具有三维结构，我们对排名前三的蛋白质（DHβ06、DHB09、DHB19）进行了研究，并使用肽进行化学合成合成器，并使用CD（圆二色性）和NMR（核磁共振）技术研究了其结构稳定性。在远紫外区的CD测量中，DHB09和DHB19具有随机卷曲状光谱，但DHB06显示出典型的α螺旋状光谱。当我们研究DHB06的温度稳定性时，我们发现它在90°C时完全变性，并且这种变性是可逆的。因此，我们利用Native和Denatured的二态转变模型对波长222 nm下CD值的热变性曲线进行了曲线拟合，得到了25 kcal/mo1的焓变，转变中点温度为 79°C。该值与野生型相当（ΔH=20 kcal/mo1，Tm=80°C）。另一方面，根据1H-NMR测量，DHB09和DHB19的一维NMR谱显示出源自氨基酸的鲜明特征。相反，DHB06 的光谱显示甲基的峰向上场移动，组氨酸残基的峰向下场移动，表明 DHB06 具有三级结构。这一结果证明了设计具有类天然状态三级结构的序列的成功。