糖鎖-オリゴDNA複合体を用いたアンチセンスオリゴDNAの細胞ターゲッティング

使用糖链-寡聚 DNA 复合物对反义寡聚 DNA 进行细胞靶向

基本信息

批准号：
12019225
负责人：
鈴木徹
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12019225/
关键词：
アンチセンス PNA GFP CAT 無細胞タンパク質合成系細胞ターゲッティシグ

项目摘要

昨年度までの研究で我々は、オリゴヌクレオチドのアンチセンス効果を、in vitro転写翻訳系を用いて効率よく評価する方法を開発した。今回は、この系を用いて、PNAとオリゴDNAの効果を客観的に評価する事を試みた。まず、in vitro転写翻訳系における、配列に依存しない非特異的影響を調べるために、12merのランダム配列を有するPNAとs-オリゴを合成し、in vitro CAT発現に対する影響を見た。その結果、S-オリゴが200nMで約50%、600nMで80%の阻害を示したのに対し、PNAは、1μM以下の濃度では、全く影響を示さなかった。これは、S-オリゴのバックボーンが、生理的pHにおいて負の電荷を有するのに対し、PNAは電荷を有しないために、電荷を有しないためであると推察された。次に、S-オリゴとPNAの効果を、最もPNAの効果が顕著であった翻訳開始点の配列(65)に関して検討した結果、で50%の阻害活性を示すために、PNAは30nM加えれば良かったのに対し、S-オリゴが900nMを必要とした。30倍強く転写を阻害する事が明らかになった。このことからもPNAが、S-オリゴに対し、より特異性の高いアンチセンス効果を示すことが明らかになった。PNAのタンパク質合成の阻害効果が、確かに塩基配列に依存したアンチセンス効果によるものであることを明らかにするため、塩基配列を置換したPNAを用いて阻害効果を見た。P65cに見られるように、1塩基の違いによってPNAの効果は1/3倍ほど高い濃度が必要出会った。また、最大活性もWildが、90%程度の阻害を見せたのに対し、65%程度に留まった。4塩基置換を行ったものに関しては全く阻害を示さなかった。以上の結果から、PNAによる阻害効果が、確かに配列特異的なアンチセンス効果による物であることが確認された。

在一项直到去年的研究中，我们开发了一种使用体外转录翻译系统有效评估寡核苷酸的反义作用的方法。在本文中，我们试图使用该系统客观地评估PNA和寡头的效果。首先，为了研究在体外转录翻译系统中与序列无关的非特异性效应，合成了具有12mer随机序列的S-Oligos，并看到了对体外CAT表达的影响。结果表明，S-Oligo在200 nm时显示出约50％的抑制作用，在600 nm时显示80％的抑制作用，而PNA在低于1μm的浓度下没有影响。据推测，这是因为S-Oligo的骨干在生理pH值下为负电荷，而PNA没有电荷，因此没有电荷。接下来，我们研究了S-Oligo和PNA对翻译起始序列的影响（65），其中PNA的作用最为明显，发现PNA应该添加到30 nm中，而S-Oligo则需要900 nm才能显示50％的抑制作用。已经揭示了它抑制转录的30倍强大。这也表明PNA对S-Oligo表现出更具体的反义作用。为了澄清PNA对蛋白质合成的抑制作用肯定是由于反义作用取决于基础序列的，我们使用了带有取代碱基序列的PNA来观察抑制作用。如P65C所示，由于一个碱基的差异，PNA的效应必须高约1/3倍。此外，WIDD还显示出约90％的抑制作用，但只有大约65％。对于接受4台替代的人来说，根本没有抑制作用。从上述结果可以证实，PNA的抑制作用确实是由于序列特异性的反义作用。