無細胞系新規タンパク質選択法の開発と有用タンパク質の創製

开发新型无细胞蛋白质选择方法并创造有用的蛋白质

基本信息

批准号：
00J05099
负责人：
藤田聡史
金额：
$ 2.3万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-00J05099/
关键词：
Selection 分子進化法 Invitro タンパク質 Tat-aptamer リシン(Ricin)リボゾーム不活性化

项目摘要

「新規機能性タンパク質の選択法」の開発はポストゲノム時代を迎えた今日、非常に注目されている。この手法を用いることにより、タンパク質のプールの中から様々な機能を持つタンパク質を見つけだしてくることが出来る。これまでに提案されている主な「タンパク質の選択法」はファージディスプレイ法、プラスミドディスプレイ法などのin vivoのステップを用いるもので、1)タンパク質の大きさが制御されたり、2)細胞毒性を示す重要なタンパク質を用いることが出来ない、3)プールの大きさが制御される、4)ホスト細胞の環境に影響される、などの問題があった。近年になり、リボゾームディスプレイ法、mRNAディスプレイ法などの完全に無細胞でタンパク質の選択を行う手段が幾つか提案された。しかし、これらの手法も複合体の安定性や手法の煩雑さが問題となり、必ずしも最適化された手法とは言えない。我々はリシンA鎖を選択の対象となるタンパク質のC端末にfusionする手法を構築し、モデルタンパク質の選択に成功した。(Zhou et al. J. Am. Chem. Soc. 2002,124,538)。この手法ではリシンA鎖タンパク質を用いることにより、タンパク質-mRNA複合体を、極めて安定に存在させる事に成功した。これにより従来の手法に比べて、初期プールのポピュレーションを大きく維持することが出来る。さらにポピュレーションを減少させるステップも少ないため、タンパク質の選択の効率が他の手法に比べて優れている。また、この手法には化学合成などの複雑なステップを伴わないため、極めて簡単に操作が行える。さらに、我々はタンパク質-mRNA複合体を、安定に存在させる事が可能となる別の手法の開発にも成功した(Fujita et al. J.Med.Chem.,2002,45,1598)。この水泡は、タンパク質-mRNA複合体を形成させるための仲介として、Tatタンパク質とTatアプタマー(RNAのモチーフ)を用いる。この二つの因子は翻訳中に極めて強く結合するため、強固な複合体の形勢が可能である。この手法もポピュレーションを減少させるステップが少なく、扱いやすい。

当我们进入基因组时代时，“选择新型功能蛋白的方法”的发展今天引起了人们的关注。通过使用此技术，可以在蛋白质库中找到具有各种功能的蛋白质。到目前为止，提出的主要“蛋白质选择方法”涉及体内步骤，例如噬菌体显示和质粒显示，并且存在诸如1）蛋白质大小的问题，2）无法使用表现出细胞毒性的重要蛋白质，3）池大小，4）受宿主细胞环境的影响。近年来，已经提出了几种方法来选择完全无细胞的蛋白质，例如核糖体显示方法和mRNA显示方法。但是，由于复合物的稳定性和复杂的方法，这些方法也存在问题，不一定要优化。我们已经构建了一种将赖氨酸A链融合到要选择蛋白质的C末端的方法，并成功选择了模型蛋白。（Zhou等人J.Am。Chem。Soc。2002,124,538）。通过使用赖氨酸A链蛋白，该技术成功地建立了蛋白质-MRNA复合物的极为稳定的存在。与常规方法相比，这允许更大的初始池种群保留。此外，减少种群的步骤较少，这使蛋白质选择比其他方法更好。此外，由于该方法不涉及复杂的步骤，例如化学合成，因此非常容易执行。此外，我们成功地开发了另一种允许蛋白质-MRNA复合物稳定存在的方法（Fujita等人J. Med。Chem。，2002，45，1598）。水泡使用TAT蛋白和TAT适体（RNA基序）作为介导以形成蛋白质-MRNA复合物。这两个因素在翻译过程中非常牢固地结合，从而实现了健壮的复合构型。该技术还涉及减少人群的步骤较少，并且易于使用。