嗅覚系における神経回路形成の分子機構-嗅神経細胞の標的特異的な軸索投射-

嗅觉系统神经回路形成的分子机制-嗅觉神经元的目标特异性轴突投射-

基本信息

批准号：
11170215
负责人：
坪井昭夫
金额：
$ 4.48万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

申請者らは、嗅細胞の嗅球への標的特異的な軸索投射の分子機構を解明する為に、先ず、マウス14番染色体上にクラスターを成す嗅覚受容体遺伝子、MOR28、MOR10及びMOR83に着目し、それらの発現と軸索投射を解析した。その結果、これら遺伝子は嗅上皮で相互排他的に発現しており、それぞれを発現する嗅細胞は、近接した3つの異なる糸球に軸索投射している事が判明した。これは嗅覚受容体遺伝子の染色体上でのlinkageと、嗅球における投射先との関連を解析した初めての報告である。我々は次に、長年の懸案であったトランスジェニックマウスにおける嗅覚受容体遺伝子の発現系の確立を試み、YAC(yeast artificial chromosome)ベクターを用いる事により世界に先駆けて成功した。このトランスジェニックマウスにおいては、460kbのYAC DNA上のMOR28遺伝子はlacZ遺伝子により標識されている。一方、外来性のMOR28遺伝子を発現する細胞と区別する為、内在性のMOR28遺伝子がGFP遺伝子により標識されたマウスをノックインの手法を用いて作製した。これらを交配したマウスを解析した結果、外来性と内在性のMOR28遺伝子は個々の嗅細胞で相互排他的に発現すること、及びそれぞれの遺伝子を発現する嗅細胞の投射先は隣接しているが異なる糸球であることが明らかとなった。また、lacZとGFP遺伝子で別々に標識した2種類のMOR28遺伝子の発現を、トランスジェニック系で解析したところ、それぞれが異なる嗅細胞で相互排他的に発現することが示された。これは、同一の染色体部位に複数個導入された同じMOR28トランスジーンの間でも、相互排他的発現の見られることを実験的に示した最初の例として注目された。申請者らはまた、上述したノックインマウスの嗅上皮からGFP蛍光を指標にMOR28発現嗅細胞を単離し、その核に関してRNA-DNA FISH(fluorescent in situ hybridization)法を用いて解析することにより、これ迄提唱されていた嗅覚受容体遺伝子のmonoallelicな発現を、単一細胞レベルで初めて証明した。更に、嗅細胞の嗅球への軸索投射に関して、ノックインマウスとトランスジェニックマウスを用いて解析した結果、嗅覚受容体遺伝子の染色体上での位置、遺伝的多型、遺伝子標識の種類及び有無などが、軸索投射を規定するパラメーターになり得ることが示された。

为了阐明嗅觉细胞靶标特异性轴突投射到嗅球的分子机制，申请人首先关注嗅觉受体基因MOR28、MOR10和MOR83，它们在小鼠14号染色体上形成簇。然后我们分析了它们的表达和轴突投射。结果表明，这些基因在嗅觉上皮细胞中相互排斥地表达，并且表达每个基因的嗅觉细胞将它们的轴突投射到三个非常接近的不同小球上。这是第一份分析嗅觉受体基因的染色体连锁与其在嗅球中的投射目的地之间关系的报告。接下来，我们尝试在转基因小鼠中建立嗅觉受体基因的表达系统，这是一个长期存在的问题，并通过使用YAC（酵母人工染色体）载体在世界上首次获得成功。在该转基因小鼠中，460 kb YAC DNA 上的 MOR28 基因被 lacZ 基因标记。另一方面，为了将它们与表达外源MOR28基因的细胞区分开来，我们使用敲入技术创建了内源MOR28基因被GFP基因标记的小鼠。通过对与这些小鼠交配的小鼠进行分析，我们发现外源性和内源性MOR28基因在各个嗅觉细胞中相互排斥地表达，并且表达各基因的嗅觉细胞的投射目的地彼此相邻。很明显它们是不同的球体。此外，当我们分析转基因系统中分别用lacZ和GFP基因标记的两种MOR28基因的表达时，我们发现它们在不同的嗅觉细胞中相互排斥地表达。这作为引入同一染色体位点的多个 MOR28 转基因之间相互排斥表达的第一个实验例子引起了人们的关注。申请人还使用GFP荧光作为指示剂从上述敲入小鼠的嗅觉上皮中分离了表达MOR28的嗅觉细胞，并首次使用RNA-DNA FISH（荧光原位杂交）分析了它们的细胞核。证明了嗅觉受体基因在单细胞水平上的单等位基因表达，这是迄今为止所提出的。此外，通过使用敲入小鼠和转基因小鼠分析嗅觉细胞向嗅球的轴突投射，我们发现嗅觉受体基因在染色体上的位置、遗传多态性以及遗传基因的类型和存在。已表明这可以是定义轴突投影的参数。