抗体固定化担体としての自己分散-凝集制御型ナノスフェアの開発

作为抗体固定化载体的自分散控制聚集纳米球的开发

• 批准号: 11167222
• 负责人: 竹山 春子
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11167222/
• 关键词: ナノスフェア; 磁気微粒子; アンカータンパク質; 抗体固定化担体; リポソーム; 有機薄膜

生体高分子の固定化担体としてのナノスフェアは、表面積、自由度における優位性から測定の高感度化、反応時間の短縮を達成するために効果的に利用される。しかしながら物性評価が困難であり、ハンドリングが煩雑であることから、その利用性は極めて制限を受ける。特に、磁気的に容易に運動制御できる磁性粒子を利用する場合、分散性を保持し、かつ高い凝集能を保つことは困難である。そこで、磁性粒子表面にpH、イオン強度により荷電を制御できる有機薄膜を融合することによって、自己分散-凝集制御が可能な磁性粒子の開発を目的とした。磁性細菌粒子は粒径50〜100mm、単磁区構造を有するマグネタイトより成る磁気微粒子である。またその表面は、ホスファチジルエタノールアミンを主成分とする脂質二重膜で覆われている。この磁性細菌粒子をモデル粒子として、分散性、抗体固定化条件について検討を行った。この性質を利用し、抗体を固定化した磁性細菌粒子の作製とイムノアッセイの高感度化に関する研究が行われている。その結果、粒子分散性は4〜7のpH変化に伴うアミノ基の極性に依存し、pH7において磁性細菌粒子の表面が負電荷を帯び、分散性が保持されることが示唆された。次に、人工的に有機薄膜を導入した磁気微粒子をDNA・抗体の固定化担体としたときの分散性や検出感度について検討を行った。DNAの担体として用いる場合、表面がマイナスにチャージしているため静電的吸着量は少量である。そこで、脂質2重膜を取り除いた磁性細菌粒子上に、1〜3つのアミノ基を有するシランカップリング剤を用いて被覆することにより表面の改質を行い、DNAの吸着量について比較した。その結果、コーティングしたシランカップリング剤のアミノ基の数が多くなるにつれDNAの吸着量の増加が確認された。さらに、同様のシランカップリング剤を用いて表面を改質した人工磁気微粒子と比較した結果、磁性細菌粒子を用いた場合、DNAの吸着量が約2倍多いことが示された。また、DNAが結合した磁気微粒子を磁気回収後に、等容量の2M NaClに懸濁したときに溶出されるDNA量について評価した結果、人工の磁気微粒子と比較して、磁性細菌粒子を用いたときには、顕著な溶出がおきていることが認められた。さらに、シランカップリング剤であるγ-aminopropyltriethoxysilane(γ-APTES)を用いて人工磁気微粒子の表面改質を行った。表面改質を行った場合、何も改質を行わない場合と比較し、凝集が起こりにくいことが示された。さらに、この粒子にgltaraldehyde(GA)、bis(sulfosuccinimidyl)suberate(BS3)を用いて架橋したところ、分散性は安定に保たれていることが示された。このような抗体固定化磁気微粒子を用いて、環境ホルモンとして問題視されているビスフェノールAの検出を行ったところ、磁性細菌粒子と比較し検出限界は劣るものの感度の面で優れていることが示された。

纳米球作为生物聚合物的固定载体有效地用于在测量和较短的反应时间中获得高灵敏度，因为它们在表面积和自由度上的优越性。但是，物理特性很难评估和处理很复杂，并且其可用性非常有限。特别是，当可以轻松地使用磁性控制的磁性颗粒时，很难保持分散性并保持高聚集。因此，目的是通过将磁性颗粒的表面与能够通过pH和离子强度控制电荷的有机薄膜来开发能够自分散和聚集控制的磁性颗粒。磁细菌颗粒是由磁铁矿制成的磁性细颗粒，其粒径为50至100 mm并且具有单个结构域结构。表面还覆盖着脂质双层膜，该膜主要由磷脂酰乙醇胺组成。使用这些磁细菌颗粒作为模型颗粒，研究了抗体固定的分散性和条件。使用该特性，已经对具有固定抗体的磁性细菌颗粒的生产进行了研究，并提高了免疫测定敏感性。结果表明，颗粒的分散性取决于与pH变化4-7相关的氨基群的极性，并且磁细菌颗粒的表面在pH 7处受到负电荷，并保持分散性。接下来，当用人为引入有机薄膜的磁性颗粒用作DNA和抗体的固定载体时，我们研究了分散性和检测灵敏度。当用作DNA载体时，静电吸附量很小，因为表面带负电。因此，通过使用具有1到3个氨基的硅烷偶联剂将磁细菌颗粒与脂质双层涂层涂层通过涂覆磁细菌颗粒的修饰，并比较吸附的DNA量。结果，随着涂层硅烷偶联剂中氨基的数量增加，吸附的DNA吸附量增加。此外，当比较人造磁颗粒的表面与类似的硅烷偶联剂时，表明当使用磁性细菌颗粒时，吸附的DNA量大约是高的两倍。此外，在磁性恢复后悬浮在相等的2M NaCl体积时，评估了与DNA结合的磁颗粒后，发现使用磁性细菌颗粒时，他们发现与人工磁性颗粒相比，它们具有明显的洗脱。此外，使用硅烷偶联剂γ-氨基丙基三乙氧基硅烷（γ-Aptes）进行了人造磁细颗粒的表面修饰。当进行表面修饰时，与未进行修改时相比，聚集的可能性较小。此外，当使用Gltraldehede（GA）和BIS（硫糖酰亚胺）链酸酯（BS3）交联时，表明分散性保持稳定。当使用此类抗体 - 毫米磁性颗粒被视为环境激素的双足A A被视为环境激素时，表明尽管检测极限不如磁性细菌颗粒，但在敏感性方面却出色。

项目成果

H. Takeyama: "Discrimination between Atlantic and Pacific Subspecies of the Northern Tuna (Thunnus thynnus) by Magnetic-Capture Hybridization Using Bacterial Magnetic Particles"Mar. Biotechnol.. (in press).

H. Takeyama：“通过使用细菌磁性粒子的磁捕获杂交来区分北方金枪鱼（Thunnus thynnus）的大西洋和太平洋亚种”Mar。

R.Sato: "Development of fully automated and rapid immunoassay of food allergen using antibody-conjugated bacterial magnetic particles."Appl.Biochem.Biotechnol.. (in press).

R.Sato：“使用抗体缀合的细菌磁性颗粒开发全自动快速食品过敏原免疫测定法。”Appl.Biochem.Biotechnol..（正在出版）。

H.Takeyama: "Discrimination between Atlantic and Pacific Subspecies of the Northern Tuna(Thunnus thynnus) by Magnetic-Capture Hybridization Using Bacterial Magnetic Particles."Mar.Biotechnol.. 2. 309-313 (2000)

H.Takeyama：“通过使用细菌磁性粒子的磁捕获杂交来区分北金枪鱼（Thunnus thynnus）的大西洋和太平洋亚种。”Mar.Biotechnol.. 2. 309-313 (2000)