セルロース結合蛋白質のアンカリングによる植物細胞壁の高機能化

通过锚定纤维素结合蛋白改善植物细胞壁的功能

基本信息

批准号：
11132232
负责人：
大宮邦雄
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Mie University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

植物細胞壁に微生物由来のセルロース結合蛋白質(CBD)をアンカリングして、堅い細胞壁繊維質を分解しやすくしたり、CBDに抗菌蛋白質を融合したりして高機能化することを究極の目的として、まず、CBDの性質検討と、植物細胞中での発現をめざした。嫌気性細菌Clostridium thermocellum F1株のキシラナーゼAに存在するCBD部分の大腸菌での発現を行った。CBDをコードする部分をPCR法で増幅し、大腸菌発現ベクターpQE30に連結し、発現を行った。大腸菌で発現したCBDを精製し、各種ポリマーへの吸着を調べた。その結果、このCBDは、キシランに最も強く吸着した。また、セルロースヘの吸着もみられたが、キシランヘの吸着に比べて弱かった。C.stercorariumのキシラナーゼAにも同じグループに属するCBDがタンデムにつながっている。そこで、これらも同様の方法で大腸菌からCBDを精製し、性質の検討を行った。その結果、C.thermocellumのCBDと同じようにキシランヘの吸着が最も強かった。これらの結果は、これらCBDをキシラン含量の多い植物の細胞壁、例えばイネやトウモロコシなどの穀類の細胞壁の改変に利用できることが示唆された。次に、これらCBDが植物中で発現できるか調べるため、CtXynAを植物用の形質転換ベクターに導入し、タバコ培養細胞に導入した。得られた形質転換体から、無細胞抽出液を調整し、ウエスタンブロッティングで酵素の発現を調べたところ、予想される分子量に反応するバンドが観察された。このことは植物細胞中でCBDが発現することを示唆している。

最终目标是将微生物来源的纤维素结合蛋白 (CBD) 锚定在植物细胞壁上，使其更容易分解坚韧的细胞壁纤维，并通过将 CBD 与抗菌蛋白融合来改善功能。 CBD 的特性及其在植物细胞中的表达。厌氧细菌热纤梭菌 F1 菌株的木聚糖酶 A 中存在的 CBD 部分在大肠杆菌中表达。通过PCR扩增编码CBD的部分，连接至大肠杆菌表达载体pQE30并表达。纯化了大肠杆菌中表达的 CBD，并研究了对各种聚合物的吸附。因此，该 CBD 对木聚糖的吸附最为强烈。还观察到对纤维素的吸附，但其弱于对木聚糖的吸附。 C.stercorarium 的木聚糖酶 A 也具有串联连接的属于同一组的 CBD。因此，我们使用相同的方法从大肠杆菌中纯化 CBD 并检查其特性。结果，热纤梭菌对木聚糖的吸附最强，与CBD相似。这些结果表明，这些 CBD 可用于修饰木聚糖含量高的植物的细胞壁，例如水稻和玉米等谷物的细胞壁。接下来，为了检查这些 CBD 是否可以在植物中表达，将 CtXynA 引入植物转化载体并引入培养的烟草细胞中。当从获得的转化体制备无细胞提取物并通过蛋白质印迹检查酶表达时，观察到响应于预期分子量的条带。这表明 CBD 在植物细胞中表达。