消化器癌における多剤耐性遺伝子発現の定量的検討

胃肠道肿瘤多药耐药基因表达的定量研究

基本信息

批准号：
10671229
负责人：
川島邦裕
金额：
$ 0.32万
依托单位：
Kawasaki Medical School
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10671229/
关键词：
薬剤耐性消化器癌 mdr mrp Competitive PCR

项目摘要

今年度は実験系を確立した。MDR、MRPの高発現株であるKB-C2よりRNAを抽出し、mdr-1、mrpの特定領域を増幅させるプライマーを使用してRT-PCR法を行い、増幅後、クローニングした。クローニングしたPCR productを制限酵素処理をしてinternal deletionを作ることによりcompetitorを作成した。mdrのPCRproductのサイズは609bpで、制限酵素NCoI+StuI処理をすることにより、120bp deletionの489bpのcompetitorを作成した。同様にmrpのPCR productは693bpで、BstP1+Stu 1処理をすることにより155bp deletionの538bpのcompetitorを作成した。このcompetitorはそれぞれ、先に使用したmdr、mrpと同じプライマーにて増幅することができ、しかもオリジナルの増幅産物とはproductの長さが異なるため、アガロース電気泳動での判別が可能であった。competitorもクローニングし、濃度を測定し保存した。competitorを既知の濃度(1amol、2amol、5amol、10amol、100amol、1fmol、10fmol、50fmol、100fmol)で添加したPCR tubeに、KBC2より抽出したtotal RNA5μgより作成したcDNAを加えてcompetitive RT-PCRをすることで、KBC2のmdr、mrpを定量的に測定することができた。KBC2を使用した予備実験を行い、PCR条件、PCR回数を決定した。以上により腫瘍のmdr、mrpを定量的に測定するcompetitive PCR法が確立された。現在、川崎医科大学にて手術を施行され、腫瘍が凍結保存されている各種消化器癌症例を対象に、今年度購入した多検体を一度に処理できるオイルフリーPCR装置を使用し、上記により確立された方法でcompetitive PCRを施行し、薬剤耐性遺伝子発現の定量を行っている。

今年我们建立了一个实验体系。从高表达MDR和MRP的KB-C2菌株中提取RNA，使用扩增mdr-1和mrp特定区域的引物进行RT-PCR，然后进行扩增和克隆。通过用限制酶处理克隆的 PCR 产物以产生内部缺失来创建竞争产品。 mdr的PCR产物大小为609 bp，通过限制性内切酶NCoI+StuI处理，产生了具有120 bp缺失的489 bp竞争者。同样，mrp PCR 产物为 693 bp，通过 BstP1+Stu 1 处理，创建了具有 155 bp 缺失的 538 bp 竞争产品。这些竞争者中的每一个都可以使用与之前使用的mdr和mrp相同的引物进行扩增，并且由于产物长度与原始扩增产物不同，因此可以通过琼脂糖电泳来区分它们。还克隆了一种竞争对手，测量并储存了其浓度。将从 KBC2 中提取的 5μg 总 RNA 制备的 cDNA 添加到含有已知浓度（1amol、2amol、5amol、10amol、100amol、1fmol、10fmol、50fmol、100fmol）竞争剂的 PCR 管中，进行竞争性 RT-PCR，结果，我们能够定量测量 KBC2 的 mdr 和 mrp。使用 KBC2 进行初步实验以确定 PCR 条件和 PCR 数量。由此建立了定量测定肿瘤MDR和MRP的竞争PCR方法。目前，我们正在使用今年购买的无油 PCR 装置，该装置可以对在川崎医科大学接受手术且肿瘤已冷冻保存的各种胃肠道癌症病例使用上述方法进行竞争性 PCR。，并对耐药基因的表达进行定量。