in vitro体外受精系を用いた被子植物の初期胚形成機構の顕微分子生物学的研究

利用体外受精系统对被子植物早期胚胎发生机制进行小分子生物学研究

• 批准号: 10182204
• 负责人: 黒岩 常祥
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10182204/
• 关键词: トレニア; in vitro; 重複受精; 胚発生; 極核; 卵細胞; 胚珠培養; 生体染色

1 トレニアのin vivo系で重複受精、胚発生を追跡柱頭に受粉した花粉は5分で発芽する。花粉管は2.3mm/hの速度で花柱の中を伸長し、4時間後、花粉管の内部で雄原細胞が分裂した。8.5時間後、花粉管は胚嚢に達し、二つある助細胞の一つに、線形装置を通過して進入した。DAPI染色で細胞核の挙動を追ったところ、受粉後9時間目に最初の精細胞が受精し、2つ目の精細胞は約5分の時間差をもって受精することが明らかとなった。受精してから1時間後に、精細胞核と卵細胞核が融合した結果、卵細胞に2個の核小体が出現した。間もなくその核は合点側に移動した。一方中央細胞では、花粉管が達する前に中央細胞の中心部に位置していた極核が卵細胞に接する位置まで移動した。そこで受精し精細胞と合体した後、再び合点側に移動した。受粉から15時間後、第一分裂が起こり、初期胚発生が始まった。2 in vitro重複受精系の確立次in vitroでの重複受精系の確立のために、上記のようなin vivoの重複受精系を参考に、花粉管と胚珠を同時に培養できる培地の開発を行った。花粉と胚珠を超低融点アガロースの固形培地に包埋して培養する方法が有効であった。同時培養を行って間もなく、花粉管は裸出胚嚢の珠孔部に向かって選択的に伸長し、線形装置に達した。胚嚢を熱処理したり、助細胞を破壊したりすると花粉管の誘導はおこらなかった。このことから、助細胞が花粉管の誘導に必要な物質を分泌していることが示唆された。しかしこの系では花粉管が胚嚢に達しても二つの精細胞を放出出来ないことが分かった。そこで、PEGとポリリジンを培地に添加したところ、80%が内容物を放出できるようになった。このような条件で重複受精した胚珠の培養を継続した結果、初期胚発生をすることが明らかになってきており、in vitroでの重複受精に成功したと考えている。今後はこの系を用いて、細胞核やオルガネラ核を生体染色し、重複受精過程から初期胚発生過程における細胞核やオルガネラ核の挙動をはじめ、諸現象の微細なステップを解明するとともに、受精後において特異的に発現する遺伝子を解析する、顕微分子生物学的方法を開発したい。

1。在5分钟内发芽的Torenia的体内体内污名系统的花粉授粉。花粉管以2.3 mm/h的速度通过样式延伸，4小时后，雄性祖细胞在花粉管内部分裂。 8.5小时后，花粉管到达胚胎囊，并通过线性装置进入了两个辅助细胞之一。当DAPI染色跟踪细胞核的行为时，揭示了第一个精子细胞在授粉后9小时受精，第二个精子细胞以大约5分钟的时间差进行受精。受精后一小时，精子细胞核和卵细胞核被融合，导致卵细胞中出现了两个核酸。很快，核移到了共轭侧。另一方面，在中央细胞中，位于中央细胞中心的极性核移动到在花粉管达到花粉管之前接触鸡蛋细胞的位置。受精后，它与精子细胞结合在一起，将其移回了结合侧。授粉十五小时后，第一师发生了，开始了早期的胚胎发育。 2接下来，建立了体外重复受精系统，为了建立体外重复受精系统，我们开发了一种培养基，该培养基允许开发一种可以同时使用上述体内重复受精系统的培养基来培养花粉管和胚珠的培养基。培养花粉和胚珠的方法可有效地将它们嵌入超低熔点琼脂糖的固体培养基中。共培养后不久，花粉管选择性地延伸至裸露胚芽的珠子额头并到达线性装置。热处理胚囊或破坏辅助细胞不会导致花粉管的诱导。这表明辅助细胞分泌诱导花粉管所需的物质。但是，发现在该系统中，即使花粉管达到胚胎囊，两个精子细胞也无法释放。因此，将PEG和聚赖氨酸添加到培养基中，并释放80％的内容。由于在这些条件下持续重复的胚珠持续培养，已经揭示了早期的胚胎发育，我们认为体外重复受精是成功的。将来，我们希望使用该系统开发一种使用细胞核和细胞器核的生物学染色的微分子生物学方法，并阐明各种现象的小步骤，包括在早期使用该系统的胚胎发育过程中细胞核和细胞器细胞核的行为，以及使用该系统的早期发育过程，以及开发一种繁殖的繁殖物。

项目成果

Miyagishim et al.: "Ordaly formation of the double ring structure for plastid and mitochondrial division in the unicellulas red alga" Planta. 206. 551-560 (1998)

Miyagishim 等人：“单细胞红藻中质体和线粒体分裂的双环结构的有序形成”Planta。

Inada et al.: "Three-dimensional analysis of the cenescence program in rice (Olyza sativa L.) coleopliles" Planta. 206. 585-597 (1998)

Inada 等人：“水稻 (Olyza sativa L.) 胚芽体衰老程序的三维分析”Planta。

Sodmergen et al.: "Potential for biparental Cytoplasmic in heritance in Jasminum officinale and Jasminum nudiflorum." Sex Plant Reprod. 11. 107-112 (1998)

Sodmergen 等人：“茉莉和裸花双亲细胞质遗传的潜力。”

Higashiyama et al: "Guidance in vitro of pollen tube to naked embryo sac of Torenia fournieri" The Plant Cell. 10. 2019-2031 (1998)

Higashiyama 等人：“花粉管体外引导蓝猪耳裸胚囊”植物细胞。