家族性筋萎縮性側索硬化症型変異を持つCu/ZnSODのGDNF/Ret系への影響

家族性肌萎缩侧索硬化症突变型 Cu/ZnSOD 对 GDNF/Ret 系统的影响

• 批准号: 10176211
• 负责人: 岩下 寿秀
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10176211/
• 关键词: GDNF; RET; 筋萎縮性側索硬化症; Cu; Zn SOD; 酸化ストレス

脊髄前角運動神経細胞には神経栄養因子作用を有するGDNF(glial cell line dcrived neurotrophic factor)の受容体であるRetチロシンキナーゼが発現している。脊髄前角運動神経細胞が変性する筋萎縮性側索硬化症の一部に常染色体優性遺伝形式をとる家族性筋萎縮性側索硬化症(FALS)があり、一部の患者においてCu/Zn-SOD遺伝子のgerm-line-mutationが見つかっている。現在、神経細胞内にてNOから生成されたperoxynitrite(酸化ストレス作用を有する)と変異Cu/Zn-SOD蛋白との反応性が高まり、神経細胞の生存に重要な蛋白質のチロシン残基等をニトロ化することが想定されている。今回、酸化ストレス及び変異Cu/Zn-SOD蛋白がRet蛋白にどのような影響を及ぼすかについて検討を試みた。1、 FALS型変異(Ala4Val,Cys6Phe,His43Arg,His46Arg,His48Gln,Asp90Ala,Gly93Ala,Glu100Gly,Asp101Gly,Ile104Phe,Leu106Valの計11種類)を有するCu/Zn-SOD cDNAを活性型Ret蛋白と共に線維芽細胞に強制発現させた。ウエスタンブロットを行うと、正常なCu/Zn-SOD蛋白とほぼ同じ高さ(約21kDa)にバンドが出るのがA4V,C6F,H43R,H46R,H48Q,G93A,L106Vの計7種類、正常よりも低い高さにバンドが出るのはD90A,E100G,D101G(約18kDa),I104F(約20kDa)の計4種類であり、蛋白の大きさとしてバラツキがあるものの、正常Cu/Zn-SOD蛋白と同じ程度に安定に発現する。2、 内因性の酸化ストレスであるperoxynitriteを作用させると、Ret蛋白のin vivo及びin vitroでのチロシンリン酸化が数倍に亢進した。現在、その作用機序について検討中である。

Ret酪氨酸激酶是神经胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的受体，具有神经营养因子作用，在脊髓腹角运动神经元中表达。家族性肌萎缩侧索硬化症 (FALS) 是肌萎缩侧索硬化症的常染色体显性遗传形式，其中脊髓腹角运动神经元退化，并且在一些患者中发现了 SOD 基因的 Cu/Zn 种系突变。目前，神经细胞中NO产生的过氧亚硝酸盐（具有氧化应激作用）与突变的Cu/Zn-SOD蛋白的反应性增加，并且对神经细胞的生存重要的蛋白质的酪氨酸残基增加。预计这次，我们试图研究氧化应激和突变 Cu/Zn-SOD 蛋白如何影响 Ret 蛋白。 1. FALS型突变的Cu/Zn-SOD（共11种：Ala4Val、Cys6Phe、His43Arg、His46Arg、His48Gln、Asp90Ala、Gly93Ala、Glu100Gly、Asp101Gly、Ile104Phe、Leu106Val）该cDNA与激活的Ret蛋白一起在成纤维细胞中强制表达。进行蛋白质印迹时，总共 7 种类型的条带（A4V、C6F、H43R、H46R、H48Q、G93A 和 L106V）出现在与正常 Cu/Zn-SOD 蛋白大致相同的高度（约 21 kDa），这高于正常高度。总共有四个条带：D90A、E100G、D101G（约 18kDa）和 I104F（约 20kDa），尽管蛋白质大小有所不同，但它们与正常 Cu/Zn-SOD 蛋白质表现出的稳定性相同。 。 2.当应用内源性氧化应激剂过氧亚硝酸盐时，Ret蛋白的酪氨酸磷酸化在体内和体外均增加数倍。其作用机制目前正在研究中。