細胞内情報伝達ネットワーク研究のための2光子励起法適用可能な機能探索分子

适用于双光子激发方法研究细胞内信号转导网络的功能探索分子

基本信息

批准号：
10169229
负责人：
中山晋介
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10169229/
关键词：
2光子励起イメージングケイジ化合物

项目摘要

1) 2光子励起イメージングの目的のために、適当なCa感受性色素の探索を行った。超短パルスレーザー光波長を適当にかえて、各種Ca感受性色素の励起波長特性を測定したところ、Oregon Green BAPTA-1を750-760nmで励起すると励起効率が良いことが分かった。この蛍光色素のモデル液を760nmで励起して、Ca濃度に対応する蛍光強度を測定したところ、1光子励起で報告されている解離定数とほぼ等しい値を得た。この色素のEmission spectrumは、1光子励起で得られたものと同等であった。通常、Ratiometric Ca濃度測定に用いられるIndo-1を700nmの超短パルスレーザー光で2光子励起したところ、蛍光は得られたが、Ca濃度の変化に対応するような蛍光強度比の変化は得られなかった。この色素のEmission Spectrumを測定したところ、高Ca濃度のSpectrumは蛍光強度が低く、1光子励起において長波長の励起光を用いたのと同等の効果であった。700nmは現実的に、この超短パルスレーザー装置の短波長限界なので、現時点でのIndo-1使用は不適切であると結論した。そこでRatiometric Ca濃度測定のために、Calcium Green-1とTexas RedのDextran結合物を用いた。Emission spectrumを測定したところ、この色素の蛍光強度比は、Ca濃度上昇に対応して変化した。2) 超短パルスレーザー光を試料面に照射して、Caged Ca化合物(DM-nitrophen)を2光子励起により光解除した。この結果起こる局所Ca濃度上昇を、共焦点装置を用いてモニターした。このCaイメージングは、Fluo-3をアルゴンレーザーで通常の1光子励起することによって行った。Fluo-3は2光子励起効率が低いため、このような2光子励起でのCaged Ca化合物解除実験でCa濃度変化を(1光子励起法で)モニターする目的に適した色素であった。Patch clamp法を用いて、カエル交感神経節細胞にも、DM-nitrophenとFluo-3を注入した。モデル液の実験と同様に局所でのCa濃度上昇が観察された。

1）我们寻找合适的钙敏感染料用于双光子激发成像。我们通过适当改变超短脉冲激光的波长来测量各种Ca敏感染料的激发波长特性，发现Oregon Green BAPTA-1在750-760 nm处激发时激发效率良好。当该荧光染料的模型溶液在 760 nm 处激发并测量与 Ca 浓度相对应的荧光强度时，获得了几乎等于单光子激发报告的解离常数值。该染料的发射光谱与单光子激发获得的发射光谱相当。当通常用于测量比率Ca浓度的Indo-1被700 nm超短脉冲激光的两个光子激发时，获得荧光，但没有观察到与Ca浓度变化相对应的荧光强度比的变化。我不能。测量该染料的发射光谱时，Ca浓度高的光谱荧光强度较低，效果相当于单光子激发中使用长波长激发光。由于700 nm实际上是这种超短脉冲激光装置的短波长极限，因此我们得出结论，当前使用Indo-1是不合适的。因此，我们使用 Calcium Green-1 和 Texas Red 的葡聚糖组合来测量比率 Ca 浓度。当测量发射光谱时，该染料的荧光强度比随着Ca浓度的增加而变化。 2)用超短脉冲激光照射样品表面，通过双光子激发来光释放笼状Ca化合物(DM-硝基酚)。使用共焦装置监测由此产生的局部 Ca 浓度增加。该 Ca 成像是通过使用氩激光器对 Fluo-3 进行传统的单光子激发来进行的。由于Fluo-3的双光子激发效率较低，因此它是一种适合在双光子激发释放笼状Ca化合物的实验中监测Ca浓度变化（使用单光子激发方法）的染料。还使用膜片钳方法将DM-硝基酚和Fluo-3注射到青蛙交感神经节细胞中。与模型溶液实验类似，观察到 Ca 浓度局部增加。