細胞内情報伝達ネットワーク研究のための2光子励起法適用可能な機能探索分子

适用于双光子激发方法研究细胞内信号转导网络的功能探索分子

基本信息

批准号：
10169229
负责人：
中山晋介
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10169229/
关键词：
2光子励起イメージングケイジ化合物

项目摘要

1) 2光子励起イメージングの目的のために、適当なCa感受性色素の探索を行った。超短パルスレーザー光波長を適当にかえて、各種Ca感受性色素の励起波長特性を測定したところ、Oregon Green BAPTA-1を750-760nmで励起すると励起効率が良いことが分かった。この蛍光色素のモデル液を760nmで励起して、Ca濃度に対応する蛍光強度を測定したところ、1光子励起で報告されている解離定数とほぼ等しい値を得た。この色素のEmission spectrumは、1光子励起で得られたものと同等であった。通常、Ratiometric Ca濃度測定に用いられるIndo-1を700nmの超短パルスレーザー光で2光子励起したところ、蛍光は得られたが、Ca濃度の変化に対応するような蛍光強度比の変化は得られなかった。この色素のEmission Spectrumを測定したところ、高Ca濃度のSpectrumは蛍光強度が低く、1光子励起において長波長の励起光を用いたのと同等の効果であった。700nmは現実的に、この超短パルスレーザー装置の短波長限界なので、現時点でのIndo-1使用は不適切であると結論した。そこでRatiometric Ca濃度測定のために、Calcium Green-1とTexas RedのDextran結合物を用いた。Emission spectrumを測定したところ、この色素の蛍光強度比は、Ca濃度上昇に対応して変化した。2) 超短パルスレーザー光を試料面に照射して、Caged Ca化合物(DM-nitrophen)を2光子励起により光解除した。この結果起こる局所Ca濃度上昇を、共焦点装置を用いてモニターした。このCaイメージングは、Fluo-3をアルゴンレーザーで通常の1光子励起することによって行った。Fluo-3は2光子励起効率が低いため、このような2光子励起でのCaged Ca化合物解除実験でCa濃度変化を(1光子励起法で)モニターする目的に適した色素であった。Patch clamp法を用いて、カエル交感神経節細胞にも、DM-nitrophenとFluo-3を注入した。モデル液の実験と同様に局所でのCa濃度上昇が観察された。

1）为了进行两光子激发成像，对适当的CA敏感染料进行了搜索。当使用超短脉冲激光波长测量各种CA敏感染料的激发波长特性时，发现在750-760 nm激发时，俄勒冈绿色BAPTA-1的激发效率很高。该模型的荧光染料液体是在760 nm处激发的，并且测量了与CA浓度相对应的荧光强度，并且一个值大约等于用单光兴激发报道的分离常数。该染料的发射光谱与单光激发获得的发射光谱相当。当通常用于比率CA浓度测量的Indo-1是在700 nm处具有超短脉冲激光光的两光仪的激发时，获得了荧光，但荧光强度比响应于Ca浓度的变化而获得了荧光强度比的变化。当测量该染料的发射光谱时，高CA浓度光谱的荧光强度较低，并且等于在单光子激发时使用长波长激发光。我们得出的结论是，700nm实际上是该超短脉冲激光器设备的短波长极限，因此目前使用Indo-1是不合适的。因此，使用绿色-1钙和德克萨斯州红的葡萄糖结合物测量比率Ca浓度。测量发射光谱时，该染料的荧光强度比随着Ca浓度的增加而发生变化。 2）将超短的脉冲激光光照射到样品表面上，笼子Ca化合物（DM-硝基苯酚）通过两光子激发光驱动。使用共聚焦设备监测局部CA浓度的增加。该CA成像是通过用氩激光器激发fluo-3激发fluo-3进行的。由于Fluo-3具有低两个光子激发效率，因此它是一种适合在这种两光子激发CA化合物去除实验中监测Ca浓度变化（通过单光子激发方法）的目的。青蛙交感神经节细胞还使用斑块夹方法向DM-硝基化和Fluo-3注射。观察到与模型溶液实验相同的方式观察到CA浓度的局部增加。