抗体H鎖CDRIIIのアミノ酸配列と抗原特異性の相関関係の解析

抗体H链CDRIII氨基酸序列与抗原特异性的相关性分析

• 批准号: 10157225
• 负责人: 黒澤 良和
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Fujita Health University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10157225/
• 关键词: 抗原=抗体反応; error-prone PCR; CDR; モデル構築; エントロピー; チトクロームC; ステロイド; 抗原=抗体反応; error-prone PCR; CDR; モデル構築; エントロピー; チトクロームC; ステロイド

本研究は、抗体V領域の中に導入されるアミノ酸配列の変異が抗体の抗原特異性及び結合力にどのような影響を及ぼすかを体系的に解析している。in vivoでは結合力の強い抗体は通常二段階で作られる。V(D)JというDNA再編成がつくり出すのが抗体のnaive repertoireであり、抗原侵入後、その抗原と結合する抗体産生細胞の抗体V遺伝子領域に体細胞突然変異が高頻度に導入され抗体が成熟する。同様のことをin vitroで再現するためにステロイドを抗原とするモデル実験を行った。11-deoxycortisol(11-DOC)に結合するSCET抗体をファージ膜上に発現させた後、最初VHのCDR中14ケ所に部位特異的変異を導入したライブラリーを作製し、cortisol(CS)を抗原としてスクリーニングした。その結果11-DOCのみならずCSにも強い結合力を示す抗体が得られた。この変異抗体のV_H遺伝子に更にerror-prone PCRによりランダムな変異を導入したライブラリーを作製し、11-DOC共存下にCSに結合する抗体を得た。その結果CSに結合し11-DOCに弱い結合性を示すクローンを数種得た。得られた抗体のコンピューターを用いた立体構造予測は、上記結果を説明できるものであった。抗チトクロームC抗体E8はV_Hの94位のグリシンをアルギニンに変換するだけで抗原結合力を失う。更なる変異をerror-prone PCRで導入してチトクロームC結合能が回復したクローンを単離して解析した。その結果V_H CDRIIIの立体構造に94位と101位のアミノ酸の組み合わせ及び27位、29位、94位の組み合わせが大きく影響することが示された。コンピューターによる立体構造予測がこの結果に理論的根拠を与えた。とりわけ101位のアスパラギン酸をアスパラギンに変化させると数10倍の結合力の増加が見られ、この結合力がいかなる物理力から誕生するか今後の解析が重要である。

这项研究系统地分析了引入抗体V区域的氨基酸序列中的突变如何影响抗体的抗原特异性和结合强度。在体内，较强的结合抗体通常分为两个阶段。 DNA重排称为V（d）J产生抗体的天真曲目，在抗原进入后，经常将体细胞突变引入与抗原结合的抗体的抗体V基因区域，从而导致成熟的抗体。为了在体外复制相同的体外，使用类固醇作为抗原进行了模型实验。在噬菌体上表达了与11-脱氧皮质醇（11-DOC）结合的cent抗体后，首先准备了一个文库，在该文库中，在VH CDR的14个位置引入了位置定向的突变，并使用皮质醇（CS）（CS）筛选为抗原。结果，不仅获得了与11-DOC而且对CS的结合强度强的抗体。在11-DOC存在下，易用的PCR进一步产生了将随机突变引入该突变抗体的V_H基因中的库，以获得与CS结合的抗体。结果，获得了与CS结合并表现出与11-DOC的弱结合的几个克隆。基于计算机的3D结构预测获得的抗体能够解释上述结果。抗周围色素C抗体E8仅通过将甘氨酸在V_H的94位转换为精氨酸而失去抗原结合强度。通过容易出错的PCR引入了进一步的突变，以恢复细胞色素C结合能力并分析分析。结果表明，位置94和101处的氨基酸的组合以及位置27、29和94的组合对V_H CDRIII的三维结构产生了重大影响。基于计算机的结构预测为此结果提供了基本原理。特别是，当位置101处的天冬酸更改为天冬酰胺时，结合力增加了几十次，而将来的分析对于确定这种结合力的物理强度很重要。