抗体H鎖CDRIIIのアミノ酸配列と抗原特異性の相関関係の解析

抗体H链CDRIII氨基酸序列与抗原特异性的相关性分析

基本信息

批准号：
10157225
负责人：
黒澤良和
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Fujita Health University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、抗体V領域の中に導入されるアミノ酸配列の変異が抗体の抗原特異性及び結合力にどのような影響を及ぼすかを体系的に解析している。in vivoでは結合力の強い抗体は通常二段階で作られる。V(D)JというDNA再編成がつくり出すのが抗体のnaive repertoireであり、抗原侵入後、その抗原と結合する抗体産生細胞の抗体V遺伝子領域に体細胞突然変異が高頻度に導入され抗体が成熟する。同様のことをin vitroで再現するためにステロイドを抗原とするモデル実験を行った。11-deoxycortisol(11-DOC)に結合するSCET抗体をファージ膜上に発現させた後、最初VHのCDR中14ケ所に部位特異的変異を導入したライブラリーを作製し、cortisol(CS)を抗原としてスクリーニングした。その結果11-DOCのみならずCSにも強い結合力を示す抗体が得られた。この変異抗体のV_H遺伝子に更にerror-prone PCRによりランダムな変異を導入したライブラリーを作製し、11-DOC共存下にCSに結合する抗体を得た。その結果CSに結合し11-DOCに弱い結合性を示すクローンを数種得た。得られた抗体のコンピューターを用いた立体構造予測は、上記結果を説明できるものであった。抗チトクロームC抗体E8はV_Hの94位のグリシンをアルギニンに変換するだけで抗原結合力を失う。更なる変異をerror-prone PCRで導入してチトクロームC結合能が回復したクローンを単離して解析した。その結果V_H CDRIIIの立体構造に94位と101位のアミノ酸の組み合わせ及び27位、29位、94位の組み合わせが大きく影響することが示された。コンピューターによる立体構造予測がこの結果に理論的根拠を与えた。とりわけ101位のアスパラギン酸をアスパラギンに変化させると数10倍の結合力の増加が見られ、この結合力がいかなる物理力から誕生するか今後の解析が重要である。

本研究系统分析了抗体V区引入的氨基酸序列突变如何影响抗体的抗原特异性和结合强度。在体内，具有强亲和力的抗体通常分两步产生。抗体的初始库是通过称为 V(D)J 的 DNA 重排产生的，抗原入侵后，体细胞突变经常被引入与抗原结合的抗体产生细胞的抗体 V 基因区，抗体成熟。为了在体外重现相同的现象，我们使用类固醇作为抗原进行了模型实验。在噬菌体膜上表达与 11-脱氧皮质醇 (11-DOC) 结合的 SCET 抗体后，我们首先创建了一个文库，其中将位点特异性突变引入 VH 的 14 个 CDR，并使用皮质醇 (CS) 作为抗原。筛选为。结果，获得了不仅对11-DOC而且对CS也显示出强结合强度的抗体。通过易错PCR将该突变抗体的V_H基因导入随机突变而制作文库，得到与11-DOC共存时与CS结合的抗体。结果，我们获得了几个与CS结合且与11-DOC结合较弱的克隆。使用计算机对获得的抗体进行三维结构预测能够解释上述结果。抗细胞色素C抗体E8仅通过将V_H的94位甘氨酸转化为精氨酸而失去其抗原结合能力。通过易错 PCR 引入进一步的突变，并分离和分析具有恢复的细胞色素 C 结合能力的克隆。结果表明，第94位和第101位氨基酸的组合以及第27位、第29位和第94位氨基酸的组合对V_H CDRIII的三维结构影响较大。基于计算机的结构预测为这一结果提供了理论依据。特别是，当101位的天冬氨酸变为天冬酰胺时，结合强度增加了数十倍，今后分析这种结合强度是由何种物理力造成的将变得很重要。