大腸菌エンドヌクレアーゼIIIの哺乳類ホモローグの遺伝子クローニングと性状解析

大肠杆菌内切酶 III 哺乳动物同源物的基因克隆和表征

基本信息

批准号：
10151232
负责人：
関周司
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞のDNAは、物質代謝、環境化学物質、放射線等で生じたフリーラジカルでたえず損傷を受け、多様な損傷塩基を生じている。これらの損傷が正しく修復されないと突然変異、発がんにつながる。本研究は、フリーラジカルで損傷されたDNAに多く見られる損傷ピリミジン塩基の修復開始に主役を演じている大腸菌のエンドヌクレアーゼIIIの哺乳類ホモローグ[遺伝子名:nth(cndonucleaseIII)-like1;シンボル、マウスmNthl1、ヒトhNTHL1:酵素名、NTHL1酵素と略記]について研究し、次の成果をえた。1. mNthl1とhNTHL1のcDNAと遺伝子をクローニングし、全塩基配列を決めた。2. 大腸菌で発現したNTHL1酵素を精製してその性状を解析した結果、本酵素が損傷DNAからチミングリコール、ウレア等の残基を除去するDNAグリコシラーゼ活性と塩基欠落部位(APサイト)の3'側に切れ目を入れるAPリアーゼ活性を備えた二価性酵素であることを明らかにした。3. APリアーゼ活性には、NTHL1酵素の212番目のリジン残基が必須で、酵素基質中間体形成に関与することを明らかにした。4. マウスおよびヒトの本遺伝子はともに、その上流に5'-to-5'配置で結節性硬化症2の遺伝子(TSC2)が近接して存在し、NTHL1とTSC2両遺伝子のプロモーターは重なり合っていると推定された。5. 5'RACEの結果から、NTHL1とTSC2両遺伝子はともに転写開始点が複数個あると推定された。6. 両遺伝子とも調べた全ての臓器で発現しており、housekeeping genesと考えられた。7. NTHL1遺伝子の下流には、3'-to-3'の配置でNa^+/H^+交換輸送体調節因子の遺伝子(SLC9A3R2と命名)が存在した。8. 本実験結果にこれまでの報告を参考にすると、ヒトではこれらの遺伝子は染色体16p13.3の位置に、セントロメア側からTSC2、NTHL1、SLC9A3R2の順に配置していると考えられた。9. 得られた成果は、当該修復機構の研究のみならず、隣接遺伝子機能の解析にも、結節性硬化症の多様な病態の解明にも重要と考えられる。

细胞DNA不断受到新陈代谢产生的自由基、环境化学物质、辐射等的损伤，导致多种碱基受损。如果这些损伤没有得到正确修复，就会导致突变和致癌。这项研究调查了大肠杆菌核酸内切酶 III 的哺乳动物同源物 [基因名称：nth(cndonucleaseIII)-like1；符号，小鼠 mNthl1]，该酶在启动自由基损伤的 DNA 中常见的受损嘧啶碱基修复中发挥主导作用。人hNTHL1：酶名，缩写为NTHL1酶]并获得以下结果。 1.克隆了mNthl1和hNTHL1的cDNA和基因，并确定了它们的完整核苷酸序列。 2. 通过纯化大肠杆菌中表达的NTHL1酶并分析其性质，我们发现该酶具有DNA糖基化酶活性，可以去除受损DNA中的胸腺嘧啶乙二醇和尿素等残基，以及碱基缺失位点的3' （AP位点）据揭示，它是一种具有AP裂解酶活性的二价酶，可在侧面产生裂缝。 3.揭示NTHL1酶的第212位赖氨酸残基对于AP裂解酶活性至关重要，并且参与酶底物中间体的形成。 4.小鼠和人类基因均在上游以5'至5'排列相邻有结节性硬化症2基因(TSC2)，并且NTHL1和TSC2基因的启动子估计存在重叠。 5.从5'RACE结果估计NTHL1和TSC2基因均具有多个转录起始位点。 6.这两个基因在所有检查的器官中都有表达，被认为是管家基因。 7. NTHL1基因下游存在一个Na^+/H^+交换转运蛋白调节基因（名为SLC9A3R2），以3'-to-3'构型存在。 8. 根据本实验的结果和之前的报道，认为在人类中，这些基因位于染色体16p13.3上，从着丝粒侧开始依次为TSC2、NTHL1和SLC9A3R2。 9. 所获得的结果被认为不仅对于研究修复机制很重要，而且对于分析邻近基因的功能和阐明结节性硬化症的各种病理学也很重要。