u鎖分子複合体のアッセンブリとシグナル伝達関連因子のクローニング

u链分子复合物的组装及信号转导相关因子的克隆

• 批准号: 08670378
• 负责人: 大西 和夫
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: 国立予防衛生研究所
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 1997
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08670378/
• 关键词: プレB細胞受容体; μ鎖分子複合体; アッセンブリ; 小胞体; シグナル伝達; 分化シグナル; クローニング

μ鎖・代理軽鎖分子複合体(プレB細胞受容体)のアッセンブリまたはシグナル伝達に関与すると考えられる因子の同定・クローニングについて2つのアプローチをとった。1つは、免疫沈降法に基づいた生化学的方法によってμ鎖・代理軽鎖と複合体を形成する分子を精製し、その部分アミノ酸配列を得、クローニングを試みる方法で、現在までに5個の異なる分子のアミノ酸部分配列を得た。これらのうち2個は未知の配列であった。このうち、抗代理軽鎖抗体で免疫沈降する分子量46kの分子から得られた25残基の未知のアミノ酸配列は、興味あるモチーフを内在しており、シグナル伝達に関与する分子である可能性が高い。現在、PCR/RACE法によるクローニングを行っている。2つめのアプローチとして、進化的に保存されたアミノ酸配列に基づくPCRプライマーをデザインすることによって、機能分子のクローニングを試みている。酵母において、小胞体に局在し、様々な分子複合体のアッセンブリの状態を反映したシグナル核に送る分子として報告されたIRE1遺伝子の中に、進化的に保存された領域を見つけた。この領域を利用したPCRプライマーを5セット作成し、PCR/RACEによるクローニングを試みている。本研究の主眼は、マウスリンパ球(B細胞)において、酵母同様、小胞体から核へのシグナル経路があるのか、あるとすればどのような因子が関与するのかを知ることであるが、このシグナル経路の存否を知る実験として、ER-retension signal(KKXX-motif)をμ鎖のC末端に付加した遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを作成した。理論的には、このトランスジェニックμ鎖は、小胞体にとどまり、細胞表面には発現しないはずである。そこで、小胞体にとどまったμ鎖・代理軽鎖分子複合体がB細胞分化シグナルの伝達を行うかを現在解析中である。

采用两种方法来鉴定和克隆被认为参与μ链/替代轻链分子复合物（前B细胞受体）的组装或信号转导的因子。一种方法是利用基于免疫沉淀的生化方法纯化与μ链和替代轻链形成复合物的分子，获得部分氨基酸序列，并尝试克隆获得不同分子的氨基酸部分序列。其中两个序列未知。其中，从用抗替代轻链抗体免疫沉淀的分子量为46k的分子中获得的25个残基的未知氨基酸序列含有令人感兴趣的基序，并且可能是参与信号转导的昂贵分子。我们目前正在使用 PCR/RACE 方法进行克隆。第二种方法尝试通过基于进化保守的氨基酸序列设计PCR引物来克隆功能分子。在酵母中，我们在 IRE1 基因中发现了一个进化上保守的区域，该区域位于内质网中，据报道是一种向细胞核发送信号的分子，反映各种分子复合物的组装状态。我们已经使用该区域创建了 5 组 PCR 引物，并尝试通过 PCR/RACE 进行克隆。这项研究的主要重点是找出小鼠淋巴细胞（B细胞）中是否存在从内质网到细胞核的信号通路，如酵母中那样，以及如果存在，涉及哪些因素，以此作为实验来确定。由于信号通路的存在，我们创建了转基因小鼠，其基因在 μ 链的 C 末端添加了 ER 保留信号（KKXX 基序）。理论上，这种转基因μ链应该保留在内质网中，而不是在细胞表面表达。因此，我们目前正在分析内质网中残留的μ链/替代轻链分子复合物是否传递B细胞分化信号。