インスリン非依存型糖尿病における非特異的GAD65抗体のepitopeの同定

非胰岛素依赖型糖尿病中非特异性 GAD65 抗体表位的鉴定

• 批准号: 07770839
• 负责人: 春日 明
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770839/
• 关键词: インスリン依存型糖尿病; GAD65抗体; epitope

1 GAD65抗体陽性のNIDDM, IDDM,およびバセドウ病を合併したIDDM患者血清を用いた。GAD65抗体は,radioligand binding assayを用いた。すなわち,ヒトGAD65遺伝子より[^<35>S]メチオニンでラベルしたrecombinant proteinを作成,緩衝液中で一晩反応させた後、Protein A-Sepharoseで沈降し,specific radioactivityを測定した。2 immunoblotting法によるlinear epitopeに対する抗体の測定:histidune-hexamer融合GAD65を精製した.同蛋白は,家兎抗GAD65抗体に対してimmunoblotting法で反応した。その蛋白を用いて患者血清をimmunoblotting法により,GAD65のlinear epitopeに対する抗体を測定したが陽性例は認められなかった。現在陽性コントロールとしてのstiff man症候群,多腺性自己免疫症候群等の血清の入手を考慮している。3 fragment peptideに対する抗体の測定:peptiede合成器によりGAD peptide247-266,524-543を作製し,共有結合が可能なplateを用いてELISAを試みたが測定法を確立しえなかった。(海外での研究でGAD67とのhybrod proteinを作製し,comformational epitopeの違いとして測定する必要があり,またこの方法では非特異抗体を鑑別できないことが明らかになった。)4 preliminary resultsではあるがGAD65抗体の検査特異性向上のためにliner epitope, fragmentに対する抗体測定法は有意義ではない可能性が示唆された。

1 使用来自GAD65抗体阳性NIDDM、IDDM和IDDM并发Graves病患者的血清。通过放射性配体结合测定使用GAD65抗体。具体地，我们创建了用来自人GAD65基因的[^ 35 S]甲硫氨酸标记的重组蛋白，将其在缓冲溶液中反应过夜，用蛋白A-琼脂糖沉淀其，并测量其特异性放射性。 2通过免疫印迹法测定针对线性表位的抗体：通过免疫印迹法纯化组氨酸六聚体融合的GAD65蛋白与兔抗GAD65抗体反应。使用该蛋白对患者血清进行免疫印迹检测，检测到针对GAD65线性表位的抗体，但未发现阳性病例。我们目前正在考虑获取僵人综合征、多腺体自身免疫综合征等血清作为阳性对照。针对3片段肽的抗体的测量：使用肽合成仪制备GAD肽247-266、524-543，并且尝试使用能够共价键合的板进行ELISA，但无法建立测量方法。 （在海外研究中，需要用GAD67创建一种混合蛋白，并测量其构象表位的差异，并且很明显，使用这种方法无法区分非特异性抗体。）4尽管这些是初步结果，这表明线性表位和片段的抗体测量方法对于提高GAD65抗体的测试特异性可能没有意义。