精巣機能を制御する新しい細胞外マトリックスタンパクの検索

寻找控制睾丸功能的新细胞外基质蛋白

• 批准号: 07770013
• 负责人: 矢間 太
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Yokohama City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770013/
• 关键词: ラット; 精巣; 細胞外マトリックス; IV型コラーゲン; ラミニン; モノクローナル抗体; SDS-PAGE; ウエスタンブロッティング

私たちは、ラット精細管細胞外マトリックス(ECM)成分を抗原に用い、マウスに免疫して幾つかのモノクローナル抗体を作成した。これらの抗体の中で精巣特異性を示すものが存在しているかを、ラット8組織(精巣・肺・肝臓・小腸・心筋・骨格筋・腎臓・脳)において蛍光抗体法を用いてスクリーニングを行った結果、12G11と言う抗体が精巣特異性を示した。この抗体を用いて凍結超薄切片法による免疫電顕を行なった結果、12G11の抗原タンパクは精細管基底膜と、筋様細胞の基底膜に局在していることが確認された。生化学的にも12G11のの精巣特異性を確認するために、同様の8種類の組織からECM成分をそれぞれ単離し、これを8モル尿素、2%メルカプトエタノールで可溶化し、この可溶化分画をアガロース電気泳動法によって分離し、次いで電気泳動的にタンパクをニトロセルロース膜に転写させ、12G11と反応させた。この結果から、生化学的にも12G11の精巣特異性が示された。アガロース電気泳動法において12G11が認識するバンドをアガロースゲルを直接切り出すことによって回収し、これを5%SDS-PAGEで分析した結果、このバンドには210、200、185および175-kDのタンパクが含まれていることが確認された。これらのバンドが分子量の大きい方からラミニンのB1・B2鎖、IV型コラーゲンのα1(IV)・α2(IV)鎖であることをウエスタンブロッティングで確認した。12G11はこれらのどのバンドにも反応を示さず、フロント部分に反応が認められたので、12G11の抗原タンパクの分子量を推定するために10%SDS-PAGE、ウエスタンブロッティングを行なった。この結果から、12G11の抗原は27-kDであることが推定された。以上の結果から、12G11が認識しているタンパクは、ラミニンやIV型コラーゲンと挙動を供にすること、今までには報告のない低分子量の精巣特異的なECMタンパクであることが示唆された。私たちは今、27-kDタンパクが単一タンパクであることを証明するために、ラット精巣ECM成分の二次元電気泳動法の確立に努力している。糖タンパクを含むECM成分の二次元電気泳動はその条件設定に予想以上の困難を強いられているが、二次元電気泳動法が確立出来れば、12G11が認識する27-kDタンパクの解析が完結すると考えている。

我们使用大鼠生精的小管细胞外基质（ECM）成分作为抗原来免疫小鼠以产生多种单克隆抗体。我们使用荧光抗体筛选了八个大鼠组织（睾丸，肺，肝，小肠，心肌，骨骼肌肉，肾脏和脑部），抗体12G11均显示出睾丸特异性。使用该抗体，使用低温超薄分段方法进行免疫电子显微镜，并证实12G11的抗原蛋白定位于生精的肾小管基底膜和肌动物细胞的基底膜。为了确认12G11生物化学的睾丸特异性，从八个类似的组织中分离出ECM成分，并用8个摩尔尿素和2％近水乙醇溶解，通过琼脂糖电泳将溶解的馏分分离，然后用电泳将蛋白质转移至硝化脂蛋白与硝化纤维蛋白和含量均与12g11。这些结果显示生化特异性为12G11。通过直接切除琼脂糖凝胶收集12G11在琼脂糖电泳中识别的条带，并通过5％SDS-PAGE分析条带，并确认该带中含有210、200、200、185和175 kD的蛋白。蛋白质印迹证实，这些条带是层粘连蛋白的B1和B2链，以及IV型胶原蛋白的α1（IV）和α2（IV）（IV）（IV）（IV）。 12G11对这些频段没有反应，并且在前部观察到反应，因此进行了10％的SDS-PAGE和WESTERT印迹，以估计12G11的抗原蛋白的分子量。该结果表明12G11的抗原为27 kd。以上结果表明，12G11识别的蛋白质具有层粘连蛋白和IV型胶原蛋白，是一种低分子量睾丸特异性ECM蛋白，到目前为止尚未报道。现在，我们正在努力建立大鼠睾丸ECM成分的二维电泳，以证明27 kD蛋白是单蛋白。含有糖蛋白的ECM成分的二维电泳被迫具有比预期的更困难的条件，但是如果可以确定二维电泳，我们认为将完成对12G11识别的27 kD蛋白的分析。