コメのプロテインホスファターゼのクローニングとその情報伝達因子としての機能の解析

水稻蛋白磷酸酶的克隆及其信号转导因子功能分析

基本信息

批准号：
07760134
负责人：
渡邉寛人
金额：
$ 0.64万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07760134/
关键词：
イネプロテインホスファターゼ

项目摘要

本研究は、植物のプロテインホスファターゼ2Aについて、イネにおける存在形態、遺伝子発現調節機構、酵素学的性質等を明らかにすることにより、植物の情報伝達機構の一端を解明し、植物生理学および基礎農学に貢献することを目的として行った。登熟期イネ種子より単離し、一次構造を決定した4種類のプロテインホスファターゼ2A (PP2A)の触媒サブユニットのmRNAの種子登熟および発芽過程における発現状態をノーザン分析によりしらべたところ、各時期を通じて構成的に発現していることが明らかとなった。mRNAの発現に対し、各種植物ホルモンの効果は見られなかった。次に、cDNAクローンを用いて、組換えタンパク質を大腸菌内で大量発現させることに成功し、これを用いてポリクローナル抗体を作製した。種子薄切片をこの抗体を用いて染色したところ、種子の広い範囲にPP2Aタンパク質が存在していることが明らかとなった。これらのことはPP2Aが種子において普遍的に重要な機能を担っていることを示唆するものであると考えられる。さらに、イネ種子より各種クロマトグラフィーによりPP2Aタンパク質を部分精製した。その結果、動物由来のPP2Aとよく似た性質をもつPP2Aが植物種子にも存在することが明らかとなった。また、イネ種子のジベレリン誘導性システインプロテイナーゼであるオリザインαおよびβ遺伝子のプロモーターとβ-グルクロニターゼ(GUS)との融合遺伝子を作製した。導入したプロトプラストにおけるGUS活性の変動を、PP2A阻害剤であるオカダ酸を作用させて分析することにより、オリザインのジベレリン応答機構におけるPP2Aの役割について検討できると考えられる。

本研究旨在通过阐明水稻中植物蛋白磷酸酶2A的存在形式、基因表达调控机制、酶学性质等，阐明植物体内的部分信息传递机制，为植物生理学和基础农业做出贡献。以贡献为目的。通过Northern分析检测四种蛋白磷酸酶2A（PP2A）催化亚基mRNA在成熟期水稻种子成熟和萌发过程中的表达状况，并确定了其一级结构。很明显，该表达式是本构式的。没有观察到各种植物激素对 mRNA 表达的影响。接下来，他们利用该cDNA克隆，成功在大肠杆菌中大量表达了重组蛋白，并用其生产了多克隆抗体。当薄种子切片用该抗体染色时，发现 PP2A 蛋白存在于多种种子中。这些发现表明 PP2A 在种子中发挥着普遍重要的功能。此外，通过各种层析技术从水稻种子中部分纯化了PP2A蛋白。结果显示，PP2A 也存在于植物种子中，其性质与动物来源的 PP2A 相似。我们还在稻苷α和β基因（来自水稻种子的赤霉素诱导的半胱氨酸蛋白酶）和β-葡萄糖醛酸酶（GUS）的启动子之间创建了一个融合基因。通过使用 PP2A 抑制剂冈田酸分析引入的原生质体中 GUS 活性的变化，可以研究 PP2A 在米锌的赤霉素反应机制中的作用。