未分化胚性腫瘍細胞特異的転写調節因子の解析

未分化胚胎肿瘤细胞特异性转录调节因子的分析

基本信息

批准号：
07780669
负责人：
根岸文子
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Sasaki Institute
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780669/
关键词：
胚性腫瘍細胞分化転写因子

项目摘要

未分化胚性腫瘍細胞特異的エンハンサーBOXDNAとその結合タンパク質の機能を明らかにするために以下の解析を行った。1.BOXDNA結合タンパク質の標的遺伝子(BOXF1)のクローニング未分化胚性腫瘍細胞F9のcDNAライブラリーから調整したcDNAをテンペレートとしBOXF1内に設定したオリゴマーとoligo(dT)をプライマーとして用いたPCR法を行った。残念ながら、BOXDNAを転写調節領域内に持つcDNAは得られなかったが、分化に伴って発現の減少するcDNAが得られた。塩基配列解析よりこのcDNAがマウスピルビン酸キナーゼM-2であることがわかった。ラットの初期胚や肝がん細胞でこの遺伝子の発現と未分化状態との関連性が報告されており、本研究はピルビン酸キナーゼM-2が未分化状態で広く働いていることを示唆するものと思われる。本研究の成果は、Biochmica et Biophysica Acta 1267(1995)135-138に報告した。2.BOXDNA結合タンパク質の精製未分化胚性腫瘍細胞P19細胞より、BOXDNA結合タンパク質の精製を試みた。得られた最終精製物が少量であったため充分な解析は行えなかったが、BOXDNA結合タンパク質の分子量が約45kDaであること、BOXDNA結合タンパク質複合体にはβ-アクチン様タンパク質が含まれることが示唆された。3.TEF-1ファミリーとの相同性を利用したBOXDNA結合タンパク質のクローニング BOXDNA結合タンパク質は、そのDNA結合配列の相同性から、TEF-1ファミリーであることが推測される。stringencyを下げたノーザン法を行ったところ、P19細胞の分化が進むにつれて新たなTEF-1ファミリーと推定されるバンドが検出された。現在、degenerateなプライマーを用いたPCR法により胚性腫瘍細胞に特異的なTEF-1ファミリーのクローニングを行っている。

进行以下分析以阐明未分化胚胎肿瘤细胞特异性增强子 BOXDNA 及其结合蛋白的功能。 1. BOX DNA结合蛋白(BOXF1)靶基因的克隆 PCR法以未分化胚胎肿瘤细胞F9的cDNA文库制备的cDNA为模板，以BOXF1和oligo(dT)中的寡聚体为引物进行。。不幸的是，我们无法获得转录调控区带有BOXDNA的cDNA，但我们确实获得了表达随分化而降低的cDNA。碱基序列分析表明该cDNA为小鼠丙酮酸激酶M-2。在早期大鼠胚胎和肝癌细胞中已经报道了该基因的表达与未分化状态之间的关系，并且这项研究表明丙酮酸激酶M-2在未分化状态下广泛发挥作用。该研究的结果报道于Biochmica et Biophysicala Acta 1267 (1995) 135-138。 2.BOXDNA结合蛋白的纯化我们尝试从未分化的胚胎肿瘤P19细胞中纯化BOXDNA结合蛋白。尽管由于最终获得的纯化产物的量少而无法进行充分的分析，但BOXDNA结合蛋白的分子量约为45kDa，这表明BOXDNA结合蛋白复合物含有β-肌动蛋白样蛋白。事情完成了。 3.利用与TEF-1家族的同源性克隆BOXDNA结合蛋白基于其DNA结合序列的同源性，推测BOXDNA结合蛋白属于TEF-1家族。当我们执行严格性较低的 Northern 方法时，随着 P19 细胞分化的进展，检测到一条推测属于 TEF-1 家族的新条带。我们目前正在使用简并引物通过 PCR 克隆 TEF-1 家族，该家族对胚胎肿瘤细胞具有特异性。