急性および慢性機械的圧迫による神経細胞障害メカニズムの解析-培養細胞系圧迫モデルを用いて-

急慢性机械压迫引起神经元损伤的机制分析——使用基于培养细胞的压迫模型——

• 批准号: 06857099
• 负责人: 大石 陽介
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: University of Occupational and Environmental Health, Japan
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06857099/
• 关键词: 神経細胞; アストロサイト; 機械的圧迫; 培養細胞; cyclic AMP; IP3; 細胞内カルシウム

神経組織の圧迫病変における神経系細胞障害のメカニズムを理解するために、培養細胞を用いて、圧迫時におけるセカンドメッセンジャーの変化を測定した。細胞培養系として1)アストロサイトcell line、 2)神経細胞cell lineを使用した。培養は密封可能なフラスコで行い、圧力計でモニターしながら、適当量のHeをボンベからフラスコ内へ圧出することにより加圧した。この条件において、培養細胞に加わる酸素分圧は一定である。加圧の強さとして、(1)760mmHg(コントロール)、(2)800mmHg、(3)880mmHg、(4)920mmHgの4種類を設定した。約5秒で設定した加圧量に達し、その後その圧を維持した。加圧して(1)1分、あるいは(2)10分(それぞれ急性、慢性モデルとする)後、最終濃度1NになるようにTCA液を加え、反応を停止させた。細胞およびメディウムを取り出し、ソニケイション後、遠心し上清液を抽出した。これにRIAを用いてセカンドメッセンジャー(cyclic-AMP,IP3)の測定を行い、蛋白補正して最終値を算出した。なお、圧迫時における細胞のviabilityは確認している。さらに各cell lineについて、顕微鏡下で上記と同様の方法で加圧しながらリアルタイムで細胞内Caの変化を測定できるチャンバーを作成した。細胞内Ca測定には蛍光プローブとしてFura-2を用い、細胞内Ca上昇により励起されたFura-2蛍光を、アルガス50(現有)を用いて視覚経時的に測定した。アストロサイトでは、加圧量の増加に伴いcyclic-AMP,IP3の変化に有意差を認めなかった。それゆえ、現在加圧量および加圧時間に変化を加え検討中である。また、アルガス50を用いた実験では加圧量に応じた細胞内Caの低下が認められ、これが加圧に応じたカバーガラスの歪みに起因するか否かについて、硬質の石英のカバーガラスおよびlong distanceの対物レンズを使用して検討している。神経細胞および両者の共存培養については、現在測定中である。

为了了解神经组织的神经细胞损伤的机制，使用培养的细胞在压缩过程中测量第二信使的变化。作为细胞培养系统，使用1）星形胶质细胞系和2）使用神经元细胞系。该培养物是在可密封的烧瓶中进行的，在用压力表进行监测时，适当的数量将其从圆柱体压入烧瓶中被加压。在这些条件下，施加到培养细胞上的氧部分压力是恒定的。设置了四种类型的压力强度：（1）760mmHg（对照），（2）800mmHg，（3）880mmHg和（4）920mmHg。大约5秒钟内达到压力量，然后保持压力。加压（1）1分钟或（2）持续10分钟（分别为急性和慢性模型），将TCA溶液添加到最终浓度1N以停止反应。去除细胞和培养基，超声处理上清液的离心和提取。使用RIA进行测量第二个使者（Cyclic-Amp，IP3），并进行蛋白质校正以计算最终值。已确认细胞在压缩过程中的生存能力。此外，对于每个细胞系，创建了一个腔室，可以实时测量细胞内Ca的变化，同时以与上述相同的方式在显微镜下加压。 Fura-2用作细胞内Ca测量的荧光探针，并使用ARGAS 50（目前可用）视觉测量了通过细胞内Ca上升激发的Fura-2荧光。在星形胶质细胞中，随着压力的增加，在环状AMP和IP3的变化中未观察到显着差异。因此，当前正在对压力和压力时间的变化进行更改。此外，在使用ARGAS 50的实验中，观察到响应压力量的细胞内Ca降低，以及这是否是由于使用硬石英盖玻璃和长距离物镜镜头研究了盖玻片对压力的扭曲。目前正在测量神经元的共培养。