ミトコンドリアHSP60の生化学的・細胞生物学的研究

线粒体HSP60的生化和细胞生物学研究

基本信息

批准号：
06740627
负责人：
山下哲郎
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Iwate University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06740627/
关键词：
HSP60 熱ショックタンパク質分子シャペロン

项目摘要

ラット肝臓よりミトコンドリア画分を調製し、イオン交換クロマトグラフィー、ショ糖密度勾配遠心分画法などによって、HSP60タンパク質を精製した。精製したHSP60タンパク質は、in vitroのシャペロニン活性を有していたが、得られたタンパク質量が少なく、多量のHSP60タンパク質を用いる生化学的性質の検討には、大腸菌によるHSP60タンパク質の発現系の構築が必要となった。すでに明らかにされているラットミトコンドリアHSP60遺伝子配列より適当なDNAオリゴマーを合成し、それをプライマーとして、PCR法を用いてラット肝cDNAライブラリーより、HSP60のcDNAを調製した。このcDNAを発現ベクター(pET15)に組込み大腸菌に導入し、形質転換株を大量培養し、産生したHSP60タンパク質の精製を行った。精製したHSP60の分子量をnaitive PAGE等によって測定した結果、大腸菌で発現させたHSP60タンパク質はモノマーになっていることが明らかになった。ミトコンドリアにおいてHSP60は、ヘプタマ-(7量体)のリング状構造をとっており、この発現系ではnativeな構造のHSP60のタンパク質は合成されなかった。その理由として、短時間に大量発現させたため、大腸菌内の分子シャペロン系が働けなかったこと、HSP60タンパク質のホールディング・アッセンブリーには、ミトコンドリア膜系に存在するシャペロンが必要であること、などが考えられる。現在、発現ベクターやコンピテントセルの種類や発現誘導の条件検討を行い、naitiveな、シャペロニン活性を有するHSP60タンパク質の調製を試みている。

从大鼠肝脏制备线粒体组分，通过离子交换层析、蔗糖密度梯度离心等方法纯化HSP60蛋白。纯化的HSP60蛋白具有体外伴侣蛋白活性，但获得的蛋白量较少，需要利用大肠杆菌构建HSP60蛋白表达系统，以研究大量HSP60蛋白的生化特性。从预先确定的大鼠线粒体HSP60基因序列合成适当的DNA寡聚物，并以此为引物，使用PCR从大鼠肝脏cDNA文库制备HSP60 cDNA。将该cDNA整合到表达载体(pET15)中，导入大肠杆菌，大规模培养转化菌株，纯化产生的HSP60蛋白。使用天然PAGE等测定纯化的HSP60的分子量，结果表明在大肠杆菌中表达的HSP60蛋白质是单体。在线粒体中，HSP60具有环形七聚体结构，并且该表达系统中未合成HSP60蛋白的天然结构。造成这种情况的可能原因包括大肠杆菌中的分子伴侣系统由于短时间内大量表达而无法发挥作用，以及线粒体膜系统中存在的伴侣是HSP60蛋白保持组装所必需的。。我们目前正在研究表达载体和感受态细胞的类型以及诱导表达的条件，并试图制备具有伴侣蛋白活性的天然HSP60蛋白。