ランダム突然変異法によるD1タンパク質プロセッシング酵素の構造と機能と解析

D1蛋白加工酶的结构、功能和随机突变法分析

• 批准号: 06740611
• 负责人: 稲垣 言要
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Okazaki National Research Institutes
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06740611/
• 关键词: 光合成; 光化学系2; D1タンパク質; プロテアーゼ; C末端切断

私は、ホウレンソウ緑葉より光化学系IIのD1タンパク質前駆体のプロセッシング酵素を高度に精製する手法を確立してきた。この科学研究費の援助によって、私は、この酵素の構造機能相関を分子生物学的手法で解明することをめざした。まず、精製された本酵素の部分アミノ酸配列を決定し、その結果をもとに、ホウレンソウ緑葉cDNAライブラリーから本酵素のcDNAクローンを単離し、その塩基配列を明らかにした。この配列から推定されるアミノ酸配列について相同性献索を行ったところ、興味深いことに、非光合成生物である大腸菌とバルトネラに見いだされたC末端近傍特異的エンドペプチダーゼと相同性があることが示された。このことは、これらのプロテアーゼが、同じ起源遺伝子により分枝した同じ反応機構のグループに属する可能性があることに加え、プロテアーゼの機能発現に重要な残基が、配列の比較によって推定できることを示唆している。これらの配列の中で相同性が特に高い領域はクラスターを形成しており、この中の2カ所のセリン、1カ所のアスパラギン酸、1カ所のグルタミン酸が、ホウレンソウを含む今まで知られている5種のC末端プロテアーゼにおいて完全に保存されていた。この残基を中心に、アミノ酸残基置換体を分子生物学的手法で作製し、酵素学的解析を行うことで本奨励研究の目的は達成されると考えた。そこで、ホウレンソウの酵素遺伝子と新たにクローニングしたランソウSynechococcus sp.PCC7002の酵素遺伝子を大腸菌発現ベクターに組み込み、大腸菌中での活性型酵素として発現する系を確立し、現在、その系で変異酵素を生産するため、ベクター中の酵素遺伝子に上記変異を導入中である。以上の1年間の研究によって「本酵素の精製法」と「本酵素の遺伝子配列とそれにより導かれる考察」について論文を執筆中である。

我已经建立了一种高度净化来自菠菜绿叶的光系统II的D1蛋白前体的加工酶。在这项科学研究赠款的帮助下，我旨在使用分子生物学方法阐明该酶的结构和功能相关性。首先，确定纯化酶的部分氨基酸序列，并根据结果，从菠菜绿叶cDNA库中分离出酶的cDNA克隆，并揭示了碱基序列。从该序列得出的氨基酸序列的同源设计表明，有趣的是，它与在非光合合成生物体大肠杆菌和Bartonella中发现的C末端特异性内肽酶是同源的。这表明，除了这些蛋白酶可能属于由相同原始基因分支的同一组反应机制外，对蛋白酶功能表达很重要的残基可以通过序列比较来估算。在这些序列中，具有特别高的同源性簇的区域，有两个丝氨酸，一种天冬氨酸和一种谷氨酸在包括菠菜在内的五个已知的C末端蛋白酶中完全保守。我们认为，可以通过使用分子生物学方法制备氨基酸残基取代并进行酶促分析，重点关注这些残基来实现这项鼓励研究的目的。因此，菠菜的酶基因和新克隆的兰花synechococcus sp。 PCC7002已掺入大肠杆菌表达载体中，以建立一种将酶表示为大肠杆菌中活性酶的系统，并为了在该系统中产生突变酶，目前正在将上述突变引入载体中的酶基因中。通过上述一年的研究，我目前正在撰写有关“这种酶的纯化方法”和“该酶的基因序列及其从中得出的考虑因素”的论文。