非天然型アミノ酸の部位特異的導入法によるチトクロムP450アミノ酸残基の役割の証明

通过位点特异性引入非天然氨基酸来证明细胞色素 P450 氨基酸残基的作用

• 批准号: 06780488
• 负责人: 木股 洋子
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780488/
• 关键词: チトクロムP450; 非天然型アミノ酸; タンパク質工学; 酵素触媒機構

チトクロムP450の幾つかの活性部位アミノ酸残基を部位特異的に非天然型アミノ酸で置換する系の確立を目指して、先ずP450camの252位へのスレオニン誘導体の導入を実施した。252位のスレオニンは従来のアミノ酸置換法による解析から、その水酸基の酸触媒としての役割が提唱されていた。本研究ではこれを検証するために、スレオニンの水酸基がメチル基で保護され酸触媒として働き得ないO-メチルスレオニン(OMe-Thr)を252位へ導入し、その酵素活性への影響を解析することを試みた。その結果を以下に述べる。1.P450camの252位へOMe-Thrを導入することに成功した。これは国内で、又、ヘム蛋白質として初めての非天然型アミノ酸の部位特異的導入例である。2.252位へOMe-Thrを導入した変異P450camを大量合成、部分精製し、酵素活性測定や分光学的解析に必要な量及び純度のP450camホロタンパクの調整法を確立した。3.上記の変異P450camの機能解析から、252位スレオニンの水酸基が遊離型であることはP450camの触媒作用に必須条件でないことが明らかになった。従って、従来のスレオニンの水酸基の酸触媒説を修正した新しい仮説-スレオニン水酸基の酸素との水素結合によって保持された水分子が酸触媒として働く-を提唱した(BBRC,1995 印刷中)。今後この新しい仮説を更に検証するため、種々の水素結合能を有するスレオニン誘導体の252位への導入を行うと共に、今回確立した手法を用いてP450camの他の活性部位アミノ酸残基の役割の解析を実施することを計画している。

为了建立一个系统，在该系统中，细胞色素P450的几个活性位点氨基酸残基被特异性地用非天然氨基酸代替，首先在P450CAM的位置252中引入苏氨酸衍生物。已经提出了使用氨基酸取代方法来促进其作为酸催化剂的作用的常规分析提出的苏氨酸。在这项研究中，我们引入了由甲基保护并不能充当酸催化剂的O-甲基硫氨酸（OME-THR），以定位252位，并分析了其对酶活性的影响。结果将在下面说明。 1。我们已成功将OME-THR引入了P450CAM上的第252位。这是日本非天然氨基酸和血红素蛋白的第一次特定地点引入。合成并部分纯化了一种在位置2.252处引入OME-THR的突变体P450CAM，并建立了一种调整P450CAM全蛋白的方法，以酶活性测量和光谱分析所需的量和纯度。 3。上面突变体P450CAM的功能分析表明，苏氨酸的羟基的游离形式252并不是P450CAM催化的必要条件。因此，我们提出了一个新的假设，该假设修改了苏氨酸中羟基的常规酸催化理论 - 由苏氨酸羟基氢键保留的水分子与氧气一起用作酸催化剂（BBRC，1995，在印刷中）。为了进一步检验这一新假设，我们计划在252位置引入具有氢键能力的多种苏氨酸衍生物，并使用这次确定的方法分析P450CAM中其他活性位点氨基酸残基的作用。

项目成果

木股洋子: "Role of Thr-252 in cytochrome P450cam:A study with unnatural amino acid mutagenesis" Biochemical and Biophysical Research Communications. (発表予定). (1995)

Yoko Kimata：“Thr-252 在细胞色素 P450cam 中的作用：非自然氨基酸诱变研究”《生物化学和生物物理研究通讯》（即将出版）。