新しい循環調節薬としてのエンドセリン変換酵素抑制薬開発のための研究

新型循环调节药物内皮素转换酶抑制剂的开发研究

基本信息

批准号：
06557008
负责人：
真崎知生 (1995)
金额：
$ 9.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至 1996
项目状态：
已结题

项目摘要

エンドセリン(ET)は内皮細胞内でアミノ酸212残基の前駆体(ヒトの場合)より、アミノ酸38残基の中間体(bigET-1)を経て生合成される。bigET-1は血管収縮活性がほとんどない。したがってbigET-1からET-1への変換は生理的に重要であると考えられる。この変換を仲介するエンドセリン変換酵素(ECE)が実際に存在することは今までの研究からわかっていた。本研究計画ではこの変換酵素のcDNAを単離し、発現させ、その基礎的性質を調べ、変換酵素抑制薬開発の基礎とすることを目的とする。本年度はまずこのcDNA単離のための方法として、逆溶血反応法を開発した。ETを分泌していないCHOK1細胞にウシ内皮細胞cDNAライブラリーをトランスフェクトさせる。一方、ET-1の抗体を赤血球に結合させ、このET-1を分泌するCHO-K1細胞を溶血反応を指標として探索した。これによってウシ内皮細胞ET-1cDNAを分泌するCHO-K1細胞を単離し、最終的にECEcDNAを単離した。その結果ECEは蛋白部分の分子量約8万、膜貫通部位を1ケ所もち、亜鉛結合部位を持つ。中性エンドペプチターゼときわめて構造の似た金属プロテアーゼであることがわかった。さらにC末端側に10個のグリコシレーション部位を持つことから、C末端部を細胞外に持ち、したがつて活性部位を細胞外に持つと考えられる。さらにこのECEはbigET-1に特異的であるが、この他にET-3に特異的なECEも存在することがわかった。

内在（ET）通过38个氨基酸的中间体（BIGET-1）合成212个氨基酸（人类）的内皮细胞（人类）。 BIGET-1几乎没有血管收缩活动。因此，从BIGET-1到ET-1的转化在生理上很重要。该研究表明，有一种实际的内在转化酶（ECE）可以促进这种转化。在本研究计划中，该研究计划的目的是构成，表达该转化酶的cDNA，检查基本特性，并成为开发转化的酶抑制药物的基础。今年，我们首先开发了一种反向溶血反应方法作为该cDNA分离的方法。转冰矿在不分泌的Chok1细胞上的洞穴内皮细胞cDNA库。另一方面，将ET-1的抗体合并到红细胞中，将分泌该ET-1的CHO-K1细胞搜索以作为指标搜索溶血反应。结果，分离了分泌洞穴内皮细胞ET-1CDNA的CHO-K1细胞，并最终分离出EceCDNA。结果，ECE的蛋白质部分的分子量约为80,000，其中之一是所有膜穿透的PERS，并且具有锌结合位点。事实证明，它是具有非常相似结构的金属蛋白酶。此外，由于C端侧有10个糖化位点，因此认为C末端位于细胞外部，但活性位点在细胞外保持。此外，该ECE是特定于BIGET-1的，但也发现ET-3中还有其他独特的ECE。