新しい循環調節薬としてのエンドセリン変換酵素抑制薬開発のための研究

新型循环调节药物内皮素转换酶抑制剂的开发研究

基本信息

批准号：
06557008
负责人：
真崎知生 (1995)
金额：
$ 9.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至 1996
项目状态：
已结题

项目摘要

エンドセリン(ET)は内皮細胞内でアミノ酸212残基の前駆体(ヒトの場合)より、アミノ酸38残基の中間体(bigET-1)を経て生合成される。bigET-1は血管収縮活性がほとんどない。したがってbigET-1からET-1への変換は生理的に重要であると考えられる。この変換を仲介するエンドセリン変換酵素(ECE)が実際に存在することは今までの研究からわかっていた。本研究計画ではこの変換酵素のcDNAを単離し、発現させ、その基礎的性質を調べ、変換酵素抑制薬開発の基礎とすることを目的とする。本年度はまずこのcDNA単離のための方法として、逆溶血反応法を開発した。ETを分泌していないCHOK1細胞にウシ内皮細胞cDNAライブラリーをトランスフェクトさせる。一方、ET-1の抗体を赤血球に結合させ、このET-1を分泌するCHO-K1細胞を溶血反応を指標として探索した。これによってウシ内皮細胞ET-1cDNAを分泌するCHO-K1細胞を単離し、最終的にECEcDNAを単離した。その結果ECEは蛋白部分の分子量約8万、膜貫通部位を1ケ所もち、亜鉛結合部位を持つ。中性エンドペプチターゼときわめて構造の似た金属プロテアーゼであることがわかった。さらにC末端側に10個のグリコシレーション部位を持つことから、C末端部を細胞外に持ち、したがつて活性部位を細胞外に持つと考えられる。さらにこのECEはbigET-1に特異的であるが、この他にET-3に特異的なECEも存在することがわかった。

内皮素（ET）通过38个氨基酸残基（BIGET-1）的中间体在212个氨基酸残基（在人类中）的前体中的内皮细胞中生物合成。 Biget-1几乎没有血管收缩的活性。因此，BIGET-1向ET-1的转化在生理上很重要。先前的研究表明，介导这种转化率的内皮素转换酶（ECE）实际上存在。该研究项目旨在隔离和表达这种转化酶的cDNA，研究其基本特性，并作为开发转化酶抑制剂的基础。今年，我们首先开发了一种抗溶血反应方法，作为分离该cDNA的方法。转染不会用牛内皮细胞cDNA库分泌ET的CHOK1细胞。同时，ET-1抗体与红细胞结合，并使用溶血反应作为指标搜索分泌ET-1的CHO-K1细胞。该分离的CHO-K1细胞分泌牛内皮细胞ET-1 cDNA，最后分离ECE cDNA。结果，ECE的分子量约为80,000,000蛋白部分，一个跨膜位点，并且具有锌结合位点。已经发现它是一种与中性内肽酶非常相似的金属蛋白酶。此外，由于C末端有10个糖基化位点，因此人们认为C端是细胞外的，因此活性位点是细胞外的。此外，尽管此ECE针对BIGET-1，但发现还有其他特定于ET-3的ECE。