アルツハイマー病脳に蓄積するPHFにおけるユビキチン結合タンパク質の同定

鉴定在阿尔茨海默病大脑中积累的 PHF 中的泛素结合蛋白

基本信息

批准号：
05780576
负责人：
森島真帆
金额：
$ 0.58万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05780576/
关键词：
アルツハイマー病 PHF ユビキチン

项目摘要

アルツハイマー病脳に蓄積するPHFはその構成成分としてタウとユビキチンが同定されている。本研究ではPHF蓄積におけるユビキチン化の意味を知るために、PHF内のユビキチンの標的タンパク質を検索しタンパク化学的に同定した。アルツハイマー病脳のサルコシル不溶性画分を塩酸グアニジンで可溶化し、TSK-G3000によるゲル濾過法で分画した後、セミマイクロボア逆相HPLCを用いて抗ユビキチン抗体で反応するPHF(SDS-PAGEでスメアを呈するのでPHF-スメアと呼ぶ)を精製した。次に精製したPHF-スメアとPHFタウ、ユビキチンをそれぞれAchromobacter lyticus proteaselで消化し、逆相HPLCで展開してペプチドマップを作製し、比較検討を行った。PHF-スメアのペプチドマップは基本的にPHFタウのペプチドマップとユビキチンのマップを合わせたものに類似していた。しかしながら幾つか異なる特徴がみられたので、PHF-スメアに特異的なピークを中心に全ピークを質量分析及びアミノ酸配列分析により解析した。その結果、PHF内ではユビキチンがタウに結合していること、その結合部位はタウの微小管結合領域に少なくとも4ヶ所存在することが明らかになった。PHF内にはモノユビキチンとマルチユビキチン鎖の両方が存在しており、分解の強力なシグナルと考えられているマルチユビキチン鎖の占める割合が少ないこともわかった。さらにPHF-スメア内のタウはN末端部分が欠如して少なくなっていることから、PHF内のユビキチンはN末端部分がprocessingを受けたタウに結合していることが示された。これらの結果は、アルツハイマー病のみに限らず種々の変性疾患で見られる細胞内封入体におけるそのユビキチン化の解析、蓄積の機構を知るうえで重要な示唆を与えるものである。

Tau 蛋白和泛素已被确定为 PHF 的组成成分，在阿尔茨海默病患者的大脑中积聚。在本研究中，为了了解泛素化在PHF积累中的重要性，我们寻找并化学鉴定了PHF中泛素的靶蛋白。用盐酸胍溶解阿尔茨海默病脑的肌酰基不溶部分，使用TSK-G3000通过凝胶过滤分级，然后使用半微孔反相HPLC使PHF（SDS-PAGE）与抗泛素抗体反应。 -涂片（称为PHF-涂片）被纯化。接下来，将纯化的 PHF 涂片、PHF tau 和泛素分别用反相 HPLC 开发的解色杆菌蛋白酶消化，并创建肽图用于比较研究。 PHF 涂片的肽图基本上与 PHF tau 和泛素图的组合肽图相似。然而，观察到一些不同的特征，因此通过质谱和氨基酸序列分析来分析所有峰，主要是PHF涂片特有的峰。结果表明，泛素与 PHF 中的 tau 蛋白结合，并且 tau 蛋白的微管结合区至少有 4 个结合位点。还发现PHF中同时存在单泛素链和多泛素链，并且被认为是强烈降解信号的多泛素链的比例很小。此外，由于缺少 N 末端部分，PHF 涂片中 tau 的量减少，表明 PHF 中的泛素与 N 末端部分已被加工的 tau 结合。这些结果为理解不仅在阿尔茨海默氏病而且在各种退行性疾病中观察到的细胞内包涵体泛素化和积累的机制提供了重要建议。