C型肝炎ウイルスプロテアーゼの発見とその性質の解明

丙型肝炎病毒蛋白酶的发现及其特性的阐明

基本信息

批准号：
05760061
负责人：
門倉広
金额：
$ 0.58万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05760061/
关键词：
C型肝炎ウイルスプロテアーゼ

项目摘要

C型肝炎の原因となるC型肝炎ウイルスは、10kbの+鎖RNAウイルスで1つの読み枠から1つの前駆体タンパク質が翻訳されたあと切断を受けて粒子形成に必要な各タンパク質がつくられる。この過程にウイルス自身のプロテアーゼ活性が必須であり、その特異的な阻害剤は治療にきわめて効果的であると期待される。本研究では、C型肝炎ウイルスプロテアーゼの酵素としての性質特にその必須領域、活性残基および基質特異性を明らかにする目的で以下の実験をおこなった。C型肝炎ウイルスと近縁のフラビウイルスではNS3領域のN末端1/3の領域にNS2、NS3間を切断するプロテアーゼ活性が存在することが確認されている。C型肝炎ウイルスの場合にもNS3領域のN末端1/3にキモトリプシン型プロテアーゼと相同性の高い部位が存在しNS2、NS3間には切断点と予想される2個の塩基性アミノ酸と側鎖の小さなアミノ酸残基からなる配列が存在している。そこでウイルスプロテアーゼ活性を検出する目的でNS2、NS3領域をウサギ網状赤血球ライセ-トをもちいた無細胞翻訳系で発現を試みた。また同領域をグルタチオン S-トランスフェラーゼとの融合タンパク質として大腸菌での発現も試みた。その結果いずれの系においても分子量から目的の遺伝子産物と判断できるタンパク質の発現には成功した。しかしフラビウイルスの場合にみられるようなプロテアーゼ活性は今回用いた領域では検出できなかった。宿主シグナルペプチダーゼの関与も考えミクロゾーム画分を加え反応を行ったが切断は見られなかった。現在、用いている領域ではプロテアーゼ活性に不十分であると考え、より広い領域について発現をおこなっている。

引起丙型肝炎的丙型肝炎病毒是一种10kb +-Strand RNA病毒，具有10Kb +-Strand RNA病毒，在一种前体蛋白质后，它从一个阅读框中翻译出来，导致每种蛋白质形成所需的每种蛋白质。该病毒自身的蛋白酶活性对于此过程至关重要，其特异性抑制剂预计将在治疗方面非常有效。在这项研究中，进行了以下实验，以阐明丙型肝炎病毒蛋白酶的酶特性，尤其是其基本区域，活性残基和底物特异性。已经证实，与丙型肝炎病毒密切相关的黄素病毒具有蛋白酶活性，在NS3区域的N末端1/3中裂解NS2和NS3之间。就丙型肝炎病毒而言，还有一个位于NS3区域N-末端的1/3位置，与Chymotrypsin-type蛋白酶高度同源，NS2和NS3之间有一个由两个基本氨基酸组成的序列，这些氨基酸由两个碱性氨基酸组成，这些氨基酸预计是exkpoints，以及小型氨基酸残基。因此，为了检测病毒蛋白酶活性，我们尝试使用包含兔子网状细胞许可的无细胞翻译系统来表达NS2和NS3区域。我们还试图将该区域表示为大肠杆菌中的谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白。结果，在任何一个系统中，都可以确定基于分子量的靶基因产物的蛋白质表达成功。但是，在这次使用的区域无法检测到黄病毒的蛋白酶活性。将微粒体馏分添加到宿主信号肽酶的参与中，并进行反应，但未观察到裂解。当前，所使用的区域被认为不足以用于蛋白酶活性，并且表达式在更广泛的区域中进行。