大腸菌細胞の全プロテア-ゼの構造と機能

大肠杆菌细胞中所有蛋白酶的结构和功能

基本信息

批准号：
03660109
负责人：
市原茂幸
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03660109/
关键词：
Escherichia coli protease membrane

项目摘要

細胞のプロテア-ゼは相互にその複雑な作用を補いあっている。一細胞におけるプロフア-ゼの相互的な役割を明らかにすることを目的とし、存在する全てのプロテア-ゼ遺伝子をクロ-ニングし、その多重欠失変異株を得ることを試みている。本研究は地道な積み重ねが必要であり、1年間で具体的な成果を挙げることはできない。計画に述べた具体的な作業がどの程度進行しているかを報告する。(1)既知プロテア-ゼ遺伝子のクロ-ニングと多重欠失変異株の作製ーーーさしあたり表層プロテア-ゼに主眼を置いている。これまでに表層に存在する9種の既知プロテア-ゼ遺伝子のうち8種のクロ-ンを得た。8種中5種(apeA,sppA,pepN,ptr and ProteaseV)の多重変異株は作製した。この5種同時欠失変異株は正常に生育することを確認した。(2)多重変異株作製法の検討ーーー目的遺伝子を薬剤耐性遺伝子と置き換え変異体を作製する方法は、薬剤耐性遺伝子の種類に限度があり、5種以上の多重変異株の作製はできない。ackA遺伝子とフルオロ酢酸を利用し、薬剤耐性遺伝子を残さず、かつポジティブに次失変異株を選択する方法を開発した。この方法によりクロ-ン化できた8種の同時欠失変異株の作製を現在試みている。(3)未知プロテア-ゼ遺伝子の検索ーーー500株のSDS感受性形質転換株からなるバンク株の活性を種々の基質を用いて測定しているが現在のところ新しいプロテア-ゼのクロ-ンは見いだされていない。本研究過程において、上記(3)のバンク中SDS感受性の顕緒なクロ-ンについては、機能を明らかにする目的で検討を行った。その結果、94.3minのkil(溶菌リポタンパク質)および、35.0minのacep(acetete permease)、5.9minの新しい外膜タンパク質、その他2種の遺伝子を新しく同定し、それらのDNA一次構造等を明かにした。

细胞蛋白酶补充彼此的复杂作用。为了阐明前言在单个细胞中的相互作用，我们试图克隆所有存在的蛋白酶基因并获得其多个缺失突变体。这项研究需要稳定的积累，并且不可能在一年的时间内取得具体的结果。报告计划中提到的特定工作正在进行多少。（1）克隆已知的蛋白酶基因并制备多个缺失突变体 - 暂时放在表面蛋白酶上。已经获得了表面层中存在的九种已知蛋白酶基因中的八个。产生了八个物种中五个的多个突变体（APEA，SPPA，PEPN，PTR和PROTEASEV）。已确认这五个共同删除的突变体是正常生长的。（2）检查创建多重突变菌株的方法-----创建突变体的方法，该突变体用耐药性基因代替靶基因的方法仅限于耐药性基因的类型，并且无法产生超过五种多重突变菌株。使用ACKA基因和氟乙酸，开发了一种方法来积极选择下一个突变菌株，而不会留下耐药性基因。我们目前正在尝试创建八个可以通过这种方法克隆的共脱落突变体。（3）搜索未知的蛋白酶基因---使用各种底物测量了由500 SDS敏感转化体组成的库活性的活性，但尚未发现新的蛋白酶克隆。在此研究过程中，对银行（3）中具有明智的SDS敏感性的上述克隆进行了检查，目的是阐明其功能。结果，新发现了另外两个基因，包括94.3分钟的KIL（裂解脂蛋白），35.0分钟的ACEP（乙酸渗透酶），新的外膜蛋白的5.9分钟和另外两个基因，揭示了其主要DNA结构。