レタス種子発芽における光誘導GA_1の受容体の単離同定

光诱导生菜种子萌发GA_1受体的分离与鉴定

基本信息

批准号：
63540526
负责人：
井上康則
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63540526/
关键词：
レタス種子発芽ジベレリン受容体フィトクロム赤色光

项目摘要

1.受容体生合成時期を確認する目的で、まずタンパク質合成阻害剤の発芽に対する効果を調べた。その結果、転写段階の阻害剤(アクチノマイシンD、αアマニチン)は、発芽をほとんど阻害せず、翻訳段階の阻害剤(シクロヘキシイミド)が効果的に発芽を阻害した。そこで、同阻害剤を異なる濃度で、異なる時間パルス的に与え、発芽のタイムコースのずれを調べたが、阻害剤処理時間以上に発芽が遅れ、傾きも緩やかになった。このことは洗浄によっても阻害剤の影響が完全には除去できないことを意味しており、阻害剤処理による発芽の遅れから、受容体合成時期を決定することは無理のあることが明らかになった。2.アフィニティークロマトグラフィーを行なうために、ジベレリン(GA)をゲルに固定することを試みた。GAは高い生理作用を示しかつ入手が容易なGA_3を選び、7位の-COOHを介してEAH-セファロースチBと、3位あるいは13位の-OHを介してエポキシ活性化セファロース6Bと結合させた。その結果、それぞれゲル1ml当り0.3μM、0.1μMのGA_3が固定された。3.GAに対する感受性測定結果から、受容体が確実に存在していると考えられる。25℃暗所で4時間培養したレタス種子20gにPVPを加え、緑色安全光下で乳鉢と乳棒ですりつぶし、セファロースG25で低分子を除いた後、2で作成した2種類のゲルに吸着させた。これを、10^<-3>MGA_3で溶出し、得られたタンパク質画分をSDSページにかけてみた。その結果数本のバンドが認められたが、2種類のゲルでバンドパターンに差がなかった。この結果は、得られたバンドが非特異的な吸着によるものであることを示唆している。さらに、どちらかのゲルに特異的なバンドを得るべく、溶出条件等を検討したが、残念ながら現在に至るまで明確な差は得られていない。

1.为了确认受体生物合成的时间，我们首先研究了蛋白质合成抑制剂对萌发的影响。结果，转录阶段的抑制剂（放线菌素D、α-鹅膏蕈素）几乎不抑制萌发，而翻译阶段的抑制剂（放线菌酮）有效地抑制萌发。因此，我们通过在不同浓度和不同时间的脉冲中应用相同的抑制剂来测试发芽的时间进程，但我们发现发芽延迟的时间比抑制剂处理时间更长，并且斜率变得更加平缓。这意味着即使通过洗涤也无法完全去除抑制剂的作用，并且显然由于抑制剂处理导致的发芽延迟而无法确定受体合成的时间。 2.我们尝试将赤霉素（GA）固定在凝胶上用于亲和层析。 GA选用生理效应高、易得的GA_3，通过7位-COOH与EAH-Sepharose B结合，通过3位或13位-OH与环氧活化Sepharose 6B结合。Ta。结果，每ml凝胶分别固定了0.3μM和0.1μM的GA_3。 3.根据GA的灵敏度测量结果，认为受体确实存在。将PVP加入25℃暗培养4小时的生菜种子20g中，在绿色安全灯下用研钵和研杵研磨，用Sepharose G25除去低分子后，吸附在两粒生菜种子上。步骤 2 中制备的凝胶类型。将其用10^-3MGA_3洗脱，并将所得蛋白质级分进行SDS页。结果，观察到多个条带，但两种类型的凝胶之间的条带图案没有差异。该结果表明所获得的条带是由于非特异性吸附造成的。此外，还研究了洗脱条件和其他因素，以获得任一凝胶特有的条带，但不幸的是，迄今为止尚未获得明显的差异。