白血球及び血管内皮細胞に於ける組織因子の発現・制御機構

白细胞和血管内皮细胞组织因子的表达及调控机制

• 批准号: 02671119
• 负责人: 田中 廣
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1988
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1988 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02671119/
• 关键词: 組織因子; 組織因子cDNA; 組織因子mRNA; RTーPCR; 組織因子の発現

止血・血栓形成に密接に関与している組織因子の発現と制御機構につき分子生物学的手法を導入する事により培養白血病細胞,白血病細胞の組織因子mRNAの発現を検討した。組織因子cDNAの同定:Spicerらにより同定された組織因子cDNAマップと組織因子アミノ酸シ-クエンスに基づき45merのオリゴヌクレオチドを合成し、これをプロ-ブとして市販の30merのプロ-ブと併せて、λgt11を用いた胎盤cDNAライブラリ-よりシグナルペプチド部分およびmature protein部分を含む1.2kbのDNA断片をえた。これを標識してプロ-ブとして用いた。細胞RNA抽出:培養白血病細胞HLー60をエンドトキシンにて経時的に刺激した後,細胞RNAをGTC/CsTFAにて抽出し,poly(A)^+ selectionし,アガロ-スゲル電気泳動後,ノ-ザンハイブリダイゼ-ションを行った。2.2kb付近に組織因子mRNAのバンドが同定され、刺激に応じて次第に濃くなり組織因子mRNA発現の増加をうかがわせた。RTーPCR法による組織因子mRNAの解析:組織因子遺伝子マップより組織因子遺伝子のエクソン1から2にまたがる24塩基を5'側プライマ-、エクソン4内の24塩基を3'側プライマ-として合成した。組織因子遺伝子DNA上は、この2つのプライマ-は7kb以上離れているが、cDNA上では410bp断片が増幅出来る筈である。培養白血病細胞HLー60及び急性白血病症例よりGTC/CsTFA法を用いて抽出した総RNA量1ー2μgを3'プライマ-を用いてcDNA合成を行ったのち、5',3'両プライマ-を用いて30サイクルのPCRを施行した。HLー60では,エンドトキシン添加で経時的に組織因子mRNAの発現増加が認められた。また臨床的にDIC症状のあるM3症例では,骨髄および末梢血白血病細胞に組織因子mRNAの発現増加が認められた。DICの認められなかったM1,M4症例では組織因子mRNAの発現は認められなかった。血管内皮細胞については現在RTーPCR法を用いて組織因子mRNA発現を検討中である。

通过引入分子生物学技术来研究与止血和血栓形成密切相关的组织因子的表达和调节机制，研究了组织因子mRNA的表达和白血病细胞。组织因子cDNA的鉴定：基于Spicer等人鉴定的组织因子cDNA图和组织因子氨基酸序列合成45mer寡核苷酸，以及使用λgt11的胎盘cDNA库制备含有信号肽部分的1.2 kb DNA片段，其中包含信号肽部分，并与λgt11一起制备质量蛋白质的部分。这被标记并用作探针。细胞RNA提取：随着时间的推移，用GTC/CSTFA，Poly（A）^+选择，琼脂糖凝胶电泳，然后进行北部杂交。在2.2 kb左右鉴定了组织因子mRNA，随着刺激逐渐变得更厚，更激烈，表明组织因子mRNA表达的增加。通过RT-PCR对组织因子mRNA的分析：从组织因子基因图中，将跨越外显子1至2的24个碱基合成为5'底漆，而在外显子4中则是3'底漆。在组织因子基因DNA上，两个引物相距7 kb以上，但是在cDNA上，应放大410 bp的片段。使用3'引物使用培养的白血病细胞HL-60和急性白血病病例从1-2μg使用GTC/CSTFA方法提取的1-2μg总RNA进行cDNA合成，然后使用5'和3'引物对PCR进行30个循环。在HL-60中，随着内毒素的添加，组织因子mRNA表达随着时间的推移而增加。此外，在具有临床症状的M3病例中，在骨髓和外周血白血病细胞中观察到组织因子mRNA的表达增加。在未观察到DIC的M1和M4病例中未观察到组织因子mRNA的表达。目前，正在使用RT-PCR研究组织因子mRNA表达的血管内皮细胞。

项目成果

田中 廣: "Analysis of leukemia cell tissue factor by western blotting technique." Thrombos.Haemostas.58. 135 (1987)

Hiroshi Tanaka：“通过蛋白质印迹技术分析白血病细胞组织因子。”Thrombos.Haemostas.58 (1987)。

田中 廣: "Production of tissue factor by leukemia cells." Thrombos.Haemostas.62. 68 (1989)

Hiroshi Tanaka：“白血病细胞产生组织因子。”Thrombos.Haemostas.68 (1989)。

田中 廣: "The leukocyte membrane and its contribution to thrombosis and haemostasisーwith special reterence to tissue fuitor." Acta Haemostol.Jpn.49. 1583-1594 (1986)

Hiroshi Tanaka：“白细胞膜及其对血栓形成和止血的贡献 - 特别涉及组织 fuutor。Jpn.49（1986）。”