両棲類に見出された"アクチン分解系"の生理的意義に関する研究

两栖动物“肌动蛋白分解系统”的生理意义研究

基本信息

批准号：
61540530
负责人：
吉里勝利
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1986
资助国家：
日本
起止时间：
1986 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

無尾両生類幼生尾部の筋組織は、アクチンをかなり特異的に分解する酵素を含む。本年はこの酵素(Protease【T_1】と名付ける。)を完全精製して次のことがらを明らかにした。1.人工基質に対する特異性。次の基質に対する活性を調べた。Z-Phe-Arg-MCA(MCA:methylcoumarinanilide),Bz-Arg-MCA,Arg-MCA,Z-Arg-Arg-MCA,Boc-Val-Pro-Arg-MCA,Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-MCA,Pro-Phe-Arg-MCA,Glt-Gly-Arg-MCA,Gly-Pro-MCA,Boc-Val-Leu-Lys-MCA,Lys-Ala-MCA,Boc-Glu-Lys-Lys-MCAなど26種について行った。このうち分解活性があったのは、Boc-Val-Leu-Lys-MCAとZ-Phe-Arg-MCAの2つで特に前者に強い活性を持っていた。Lys,Argなどの塩基性アミノ酸のカルボキシル基側をよく切断するらしい。この基質特異性からも、Protease【T_1】はカテプシン群の酵素とは考えにくく、かなりユニークな酵素と考えられる。2.酵素阻害因子の性質について。本酵素は、精製のある段階まで、阻害因子と結合しており、native actinを切断できない。このenzyme-inhibitor複合体を使って、両者の解離条件を調べた。pH4以下の酸性条件で透析を行うと、阻害因子は解離して透析外液に出てきた。そして、酵素はnative actinを切断するようになる。また外液と内液を再構成することにより、複合体が再形成されることを確認した。このようにProtease【T_1】の活性発現には、組織内のpHが関与していると考えられる。3.Protease【T_1】に対する抗体。精製酵素をウサギに免疫してtiterの高い抗体を得ることができた。この抗体と尾部の各種組織の抽出液と反応させてオクタロニー判定を行ったところ、変態最盛期の収織尾部筋組織にのみ酵素が存在することがわかった。さらに間接蛍光抗体法で調べたところ、筋組織は陰性で、崩壊筋周辺の間充織が強陽性であることがわかった。今後この抗体を使って、Protease【T_1】の合成速度の調節などの問題解明に研究を進めたい。

无尾两栖动物幼虫尾部的肌肉组织含有以高度特异性方式降解肌动蛋白的酶。今年，我们完全纯化了这种酶（命名为蛋白酶[T_1]）并阐明了以下内容。 1.对人造基质的特异性。研究了针对以下底物的活性。 Z-Phe-Arg-MCA(MCA:甲基香豆素苯胺)、Bz-Arg-MCA、Arg-MCA、Z-Arg-Arg-MCA、Boc-Val-Pro-Arg-MCA、Boc-Ile-Glu-Gly-Arg -MCA，Pro-Phe-Arg-MCA，Glt-Gly-Arg-MCA，Gly-Pro-MCA，Boc-Val-Leu-Lys-MCA，Lys-Ala-MCA，Boc-Glu-Lys-Lys-MCA我们调查了 26 个物种。其中，有两种具有降解活性：Boc-Val-Leu-Lys-MCA和Z-Phe-Arg-MCA，其中前者具有特别强的活性。它似乎经常裂解赖氨酸和精氨酸等碱性氨基酸的羧基。由于这种底物特异性，蛋白酶[T_1]不太可能是组织蛋白酶组的酶，并且被认为是一种非常独特的酶。 2.关于酶抑制剂的性质。该酶与抑制剂结合，在纯化到一定阶段之前不能裂解天然肌动蛋白。使用这种酶-抑制剂复合物，我们研究了两者的解离条件。当在 pH 值低于 4 的酸性条件下进行透析时，抑制因子会解离并进入透析液中。然后酶开始切割天然肌动蛋白。我们还证实该复合物是通过重构外部和内部流体而重新形成的。因此，组织内的 pH 值被认为与蛋白酶 [T_1] 活性的表达有关。 3.蛋白酶抗体[T_1]。通过用纯化的酶免疫兔子，我们能够获得高效价的抗体。当将该抗体与尾部各种组织的提取物反应并进行Ouchterlony测定时，发现该酶仅存在于变态高峰期的尾部肌肉组织中。使用间接荧光抗体法进一步研究发现，肌肉组织呈阴性，但解体肌肉周围的间质呈强阳性。未来我想利用这个抗体进行研究，阐明蛋白酶合成速率的调控等问题[T_1]。