疾患特異的ヒトiPS細胞を用いた軸索輸送におけるoptineurinの役割の解明

使用疾病特异性人类 iPS 细胞阐明 optineurin 在轴突运输中的作用

• 批准号: 22KJ2329
• 负责人: 菊本 舞
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2329/
• 关键词: 家族性筋萎縮性側索硬化症; optineurin; 神経軸索; iPS細胞; 逆行性軸索輸送

本研究の目的は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の発症において重要と考えられている逆行性軸索輸送障害に及ぼす変異型optineurin(OPTN)の影響を解明することである。代表研究者は、逆行性軸索輸送に関与するモーター蛋白質であるdyneinがOPTNと相互作用する点に着目し、変異型optineurinが軸索での逆行性輸送障害を引き起こす可能性を考え、特にマイトファジー障害と生存シグナルの低下との関連性について検討を行う研究計画を立案した。令和4年度に実施した内容として、まず健常者由来iPS細胞株であるHPS4290を用いて、ダイレクトコンバージョン法による運動ニューロンへの分化を行った。脊髄運動ニューロンへの分化に必要な転写因子であるNeurogenin2、Islet-1、LIM-Homeobox3遺伝子をenhanced PiggyBacベクターを用いてエレクトロポレーションで導入し、Tet-On発現誘導システムを用いて分化誘導を行った。分化誘導終了後、軸索伸長が十分に得られた時点で脊髄運動ニューロンの分化マーカーであるChAT、Hb9 (MNX1)、Tuj1の発現を蛍光免疫染色で確認した。その後同様の手法でoptineurin変異(ミスセンス変異E478Gヘテロ接合およびナンセンス変異Q398*ホモ接合)を持つ患者由来iPS細胞3株を分化させて形態観察用チャンバーでの培養を行い、細胞体と軸索の分離を行って軸索観察を行うための実験系を確立した。今後はこの系を用いて、各株におけるOPTN、dyneinの軸索での発現と相互作用の有無を評価し、さらにミトコンドリア逆行性輸送および生存シグナル伝達に及ぼす影響を検証する予定である。

这项研究的目的是阐明突变型神经磷酸酶（OPTN）对逆行轴突运输障碍的影响，这在肌萎缩性侧向硬化症（ALS）的发展中被认为很重要。领先的研究人员的重点是Dynein是一种参与逆行轴突运输的运动蛋白，与OPTN相互作用，并考虑了突变体果蛋白可能会在轴突中引起逆行转运障碍的可能性，并提出了一项研究计划，以专门检查线粒体疾病与生存信号之间的关系。作为2022财政年度实施的一部分，源自健康个体的IPS细胞系HPS4290被用来使用直接转换方法分化为运动神经元。使用增强的PiggyBac向量对分化为脊柱运动神经元所需的转录因子，Neurogenin2，Islet-1和Lim-Homeobox3基因，使用Tet-On-On-On-On表达诱导系统诱导分化。在诱导分化后，当轴突延伸充分获得时，通过荧光免疫染色证实了脊柱运动神经元，CHAT，HB9（MNX1）和TUJ1的分化标志物的表达。随后，使用类似的方法将3个IPS细胞与Optineurin突变患者（错义突变E478G杂合性和胡说八道突变Q398*纯合性）进行培养，并在形态学观察室中进行培养，并建立了一个实验性系统，以分离细胞和轴突以进行轴突观察。将来，该系统将用于评估每个菌株中OPTN和动力蛋白的轴突表达和存在，并进一步检查对线粒体逆行转运和存活信号的影响。

项目成果

“Raisin bread sign” as a radiological feature of patients with pontine autosomal dominant microangiopathy and leukoencephalopathy

“葡萄干面包征”作为桥脑常染色体显性微血管病和白质脑病患者的放射学特征

• 发表时间: 2022
• 作者: Mai Kikumoto;Takashi Kurashige;Tomohiko Ohshita;Kodai Kume;Tomohisa Nezu;Shiro Aoki;Kazuhide Ochi;Hiroyuki Morino;Eiichi Nomura;Hiroshi Yamashita;Mayumi Kaneko;Hirofumi Maruyama;Hideshi Kawakami
• 通讯作者: Hideshi Kawakami

“Raisin bread sign” is a specific radiological feature of Pontine Autosomal Dominant Microangiopathy and Leukoencephalopathy

“葡萄干面包征”是脑桥常染色体显性微血管病和白质脑病的特定放射学特征

• 发表时间: 2022
• 作者: Mai Kikumoto;Takashi Kurashige;Tomohiko Ohshita;Kodai Kume;Tomohisa Nezu;Shiro Aoki;Kazuhide Ochi;Hiroyuki Morino;Eiichi Nomura;Hiroshi Yamashita;Mayumi Kaneko;Hirofumi Maruyama;Hideshi Kawakami
• 通讯作者: Hideshi Kawakami